Western免疫印迹 总结版

Western免疫印迹(WesternBlot)

一・原理：

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经

过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，

且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,

经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。也应用于检测蛋白水平的表达。

试剂

1.裂解液：碧云天RIPA裂解液(强)主要成分为：50mMTris(pH7.4),150mMNaCl,l%TritonX-l()(),I%sodium

deoxycholate,0.1%SDS,以及2mMsodiumpyrophosphate,25mM[3-glycerophosphate,ImMEDTA,ImM

Na3Vo4,0.5ug/mlleupeptin等多种抑制剂。

2.PSMF：中文-苯甲基磺酰氟，有剧毒；在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中；

lOOmmol/LPMSF溶液配制方法：溶解174mg的PMSF于足量的异丙醇中，定容到10ml,分装成小份贮存

于-20℃,使用时终浓度一般为lmmol/L。

3.裂解液(含PMSF)的配制；1ml裂解液加100mM的PMSF1()W(只是比例关系，根据样品量计算出裂解

液的实际体积再配制相应的裂解液)。PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合

4.丙烯酰胺和N,N'亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双百稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰

胺和l%(w/v)N,N：亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N：亚甲双丙稀酰胺1g,加H?0至lOOmlo)储

于棕色瓶，4c避光保存。严格核实PH不得超过7Q因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期

不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

5.TEMED原溶液N,N,N，N，四甲基乙二胺催化过硫酸钱形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，

爰合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液APS：lg+10ml水，提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

临用前配制，配好后4℃可存放1周左右，过期会失去催化效果。

6.SDS加样缓冲液：pH6.8,0.5mol/LTris缓冲液8ml,甘油6.4ml,IO%SDS12.8ml,筑基乙醇3.2ml,

0.05%澳酚蓝1.6ml,H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在煮5min后再上样。

7.SDS跑胶缓冲溶液(Tris-甘氨酸电泳缓冲液)：3.03gTris,14.4g甘氨酸，1gSDS,用蒸僧水溶解至

IL,得0.025mol/LTris-1.92moi/L甘氨酸电极缓冲液。PH~8.3,室温保存，可重复3-5次。

十二烷基硫酸钠SDS10%(w/v)溶液：1gSDS,10mlH2O去离子水配制，室温保存。

8.彩色Marker：确保参比蛋白和目标蛋白范围清晰，易切割分离。(不要加热)

9.转膜液：3.03gTris,14.4g甘氨酸，200ml甲醇，用蒸储水定容至IL,PH~8.3,室温保存，可重复3-5次。

10.TBS缓冲溶液(10x)：24.2gTris(200mM)+80gNaCl(1.37M)+水定容到IL,用盐酸调PH至7.4。

II.11^T缓冲溶液：以丁1^缓冲溶液+0.01%twcen-20+水定容(现配现用)

12.封闭液：5%脱脂奶粉(w/v)TEST溶液(可以加入2%羊血清，这样可以减少非特异性结合)：5g脱脂奶粉

+100mlPBST缓冲一现配现用

三.应用：

1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；

2.定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；

3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

四.操作步骤：

1.蛋白样品制备（很关键）

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

方法一：

①倒掉培养液，用3mlPBS（0.01MpH7.2~7.3）共清洗3次。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

②按样品数量配制好裂解液（含PMSF）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

④每瓶细胞加400M含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

⑤裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离

心管中。（整个操作尽量在冰上进行,）

⑥于4c下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

⑦将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存,

方法二（简便一些）：

①去除培养液，用PBS清洗2-3次。

②用胰酶消化细胞（如MCF-7,3.5cm皿：500ulPBS+3滴胰酶,消化3min,观察细胞是否变圆可适当延长消

化时间，不要让太多的细胞悬浮起来），去除消化液，加培基，吹洗细胞，转移到1.5ml离心管中，离心，去

除培基，用PBS清洗（吹洗一离心一去除PBS）,将PBS弃净后把细胞置于冰上。

③按样品数量配制好裂解液（含PMSF）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

④往细胞中加入裂解液（含PMSF）：3.5cm皿+50ul,6cm皿+80ul,裂解液越多，蛋白的含量越少，于冰上裂解

30min,为使细胞充分裂解可以每隔lOmin震荡，一次10s。

⑤裂解完后，于4℃于13000rpm离心1（）min。（提前开离心机预冷）

⑥离心后取上清到干净的管子中，-20C或-80℃保存。

（2）组织中总蛋白的提取：

①将少量组织块置于1〜2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

②加400ul含去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

④裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4c下12000rpm离心5min,取上清

分装于0.5ml离心管中并置于-20C保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（1）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞

总蛋白的提取：

①将培养液倒至1.5ml离心管中，于2500rpm离心5min。

②弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

③用枪洗干上清后，加lOOpl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

④将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm离心5min,取上清于0.5ml离心管中并于一20℃保存。

2.蛋白含■的测定（碧云天BCA试剂盒）

（I）制作标准曲线

①配制蛋白备准品；蛋白标准配制液1.2mil蛋白标准BSA30mg——充分溶解，制得25mHm1的蛋白标准溶液。

再稀释0.5mg/ml（蛋白样品在什么溶液中，标准品就用什么溶液稀释，也可以直接用0.5%MaCl或PBS）

②BCA工作液配制（体积比：A液/B液二50:1）

以一个样品为例：200ulA液+5ulB液——205U1BCA工作液。

③标准蛋白和样品蛋白配制（先加蛋白一再稀释液一再BCA工作液）

（2）检测样品蛋白含量

标准液浓度体积PBS体积BCA工作液

样品：用PBS稀释一定的倍数（使得吸光度落入标准曲

0mg/mlOul20ul200ui

线的线性范围内）+200ul工作液。

0.025119200

反应条件：

0.05218200

①37℃：20-30min

0.1446200

②或室温：2h

0.2812200

③或6（）℃：30min

0.3128200

0.4164200

在540-590nm间有吸光，读取562nm处的吸光值

0.52()0200

蛋白样品6cm皿一般稀释10-12倍（可以先估计一下浓度再稀释），用PBS

3.SDS-PAGE电泳：

（1）清洗玻璃板，用蒸t留水冲洗干净后晾干（或用滤纸吸干）。

（2）灌胶与上样

①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上，灌满水捡漏（等待Imin观察液面），再灌胶。

②按配方配制一定浓度的分离胶（根据蛋白的分子量选择），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶（轻轻颠倒混匀，

注意不要有气泡）。5ml胶沿玻璃灌入（待胶面升到绿带中间线高度时即可）。然后胶上加一层异丙醇（200ul）,

液封后的胶凝的更快。

灌狡时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

③当异丙醇和胶间有一条折射线时，说明胶已凝了（一般是30mhi左右）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶

上层异丙醇，用400ul水冲洗一下，再用吸水纸吸干。一定要干透这样才不会影哂下一步浓缩胶的制备

④配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶

时也要使胶沿玻璃板流下以免有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，竖直向上轻轻

拔出梳子。

⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边

要垫一块塑料板且有字的一面面向外）

⑥测完蛋白含量后，计算含20・5011g蛋白（如果目的条带消失，可以适当提高上样的蛋白量）的溶液体积即为

上样量。取出上样样品至200ul管中，加入5xSDS上样缓冲液至终浓度为lx（师兄他们是0.5X的样子）。上

样体积不要相差太大，总体积一般不超过20Mlo上样前要将样品（含上样缓冲loadingbuffer）于沸水中煮5min

使蛋白变性（Marker不能加热，5ul）。三组平行样（为了至少能获得一组有用的数据，看情况来）

⑦加足够的runningbuffer电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）

•样品吸出不要吸进气泡，缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）

•第一个孔和最后一个孔以及空出多余的孔用lx上样缓冲补满（用水稀释，煮沸）

•一个样品可能要吸几次，当剩余的量很少时，可以加入一点runningbuffer,这样试剂不会飘，好上样些

•两层胶的作用：由于电泳缓冲液和凝胶中的离子不同，浓缩胶使蛋白分子浓缩集中于一条窄带上；进入分离

胶后蛋白分子按分子量大小分高开来。

（3）电泳

预跑：80V,5（）min：marker分出明显条带，loadingbuffer跑成一条水平线，蛋白跑到浓缩胶和分离胶的界面。

调高电压120V,2h+左右，自己要的蛋白所对应的marker清晰显现，条带在胶的底端（尽可能的不要让loading

buffer跑出来，因为runningbuffer要重复利用，不要污染）runningbuffer跑太多次后要换新（电压可能上不去）

4.转膜（黑海绵—滤纸—胶—膜—滤纸—红海绵）

（1）转一张膜需准备12张7.O-8.3cm的滤纸和1张7.3〜8.6cm的硝酸纤维素膜PVDF（有0.22um和0.45um

的规格，根据蛋白的分子量来选择，小一小）。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

（2）PVDF膜用甲醇活化5min+（任何时候膜都不能干）。在加有转移液的盘（没过底部的样子，能浸湿器材

就可以）里放入转膜用的夹子、滚轴、镜子、两块海绵垫、滤纸。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用滚轴来回擀几遍擀走气泡。（一手擀另一手要

压住垫子使其不能随便移动。）在海绵上垫6层滤纸，一层铺一层擀气泡（先用一边接触，再放下去）。

（4）先将玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。在分

离胶两侧划一刀，这样更好的剥离分离胶，

（5）小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用滚轴擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上，要

盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖6张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下

就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短

路，（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

（6）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面（负极），夹的白面对槽的红面（正极）。两块海绵都

放进去，加满转膜液，将仪器放在冰盒中（电转移时会产热，冰来降温，尤其是负极）。1（X）V,213mA,2h（观

察电压上去了没，若没有可能是转移液要换了，电流一定要上去）20KD的蛋白恒压100V转L5h足够。

•负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动；

•大分子蛋白（＞100kd）易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度（）.1%的SDS,可以

避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醉的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉

淀，（降低转膜缓冲液中甲醇的比例会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜）

•SDS妨碍蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加SDS,保持甲醇的浓度20%。

5.免疫反应

（1）配制5%脱脂奶粉作为封闭液15g脱脂奶粉+100mlPBST缓冲一现配现用）将海绵夹子取出，根据marker

切取自己的目标条带和参比蛋白条带（分清楚，可以在膜的右上角剪个口子，标记正反面，便于拍胶），室温下

脱色摇床上摇动（大概200r,自己调整）封闭lh（可以延长时间，减少非特异性结合）。

（2）用TBST清洗膜3遍（2ml,摇床晃动，清洗5min）,倒掉TBST,加入用TBST稀释至适当浓度的一抗（看

蛋白与抗体的结合能力决定稀释的倍数）；在脱色摇床上摇动过夜孵育（理想是4c,12h以上）。

1：1000为例：1W抗体/1ml封闭液，充分混匀，使硝酸纤维素膜浸在此抗体中或封闭在塑料薄膜袋中

（3）用TBST缓冲清洗膜3遍（脱色摇床摇动5min每次），室温下孵育二抗2h（也用TBST稀释），可适当减

少口寸长，结束后用TBST在脱色摇床上洗3次，每次5min,加入TBST浸没膜，防止变干（否则显影易产生高

背景）。抗体都可以回收利用，4℃俣存

6.化学发光，显影，定影（ECL）

一般使用辣根过寂化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1.HRP-ECL发光法：

（1）将A、B发光液按等比例稀释混合。

（2）根据信号的强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；

江：背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时问长达半小时，出现背景是正常的。

Table1ResolvinggelsfordenaturingSDS-PAG

一八-一各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量

各种组分名称

5ml10ml15ml20ml25ml30ml40ml50ml

6%Gel

H2O2.65.37.910.613.215.921.226.5

30%Acrylamide1.02.03.04.05.06.08.010.0

1.5MTris-Hd(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.5

10%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5

10%过硫酸铁0.050.10.150.20.250.30.40.5

TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04

8%Gcl

H2O2.34.66.99.311.513.918.523.2

30%Acrylamide1.32.74.05.36.78.010.713.3

1.5MTris-Hcl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.5

10%SDS0.05().10.150.20.250.30.40.5

10%过硫酸铁0.050.10.150.20.250.30.40.5

TEMED().(X)30.006O.(X)90.0120.0150.0180.024().03

10%Gel

H2O1.94.05.97.99.911.915.919.8

30%Acrylamide1.73.35.()6.78.310.013.316,7

1.5MTris-Hcl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.5

10%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5

10%过硫酸铁0.050.10.150.20.250.30.40.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02

12%Gel

H2O1.63.34.96.68.29.913.216.5

30%Acrylamide2.04.06.08.010.012,016.020,0

1.5MTris-Hcl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.5

10%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5

10%过硫酸铁0.050.10.150.20.250.30.40.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02

l5%Gel

H2O1.12.33.44.65.76.99.211.5

30%Acrylamide2,55.07.510.012.515.020.025.0

l.5MTris-Hcl(pH8.8)1,32.53.85.06.37.510.012.5

10%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5

10%过硫酸铁0.050.10.150.20.250.30.40.5

TEMED