CN115418362B 共固定化酶、其制备方法及其应用 （吉林凯莱英医药化学有限公司）

201911216462.62019.12.02酶为一种且通过非共价方式固定于氨基树脂载2主酶和辅酶，所述主酶共价固定于所述氨基树脂载体上，所述所述非共价方式固定是通过PEI以离子吸附的方式吸附于所述氨基树所述氨基树脂载体选自如下任意一种：LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、HFA、B.thuringiensis或VibriofluvialisstrainJ所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus或Bacillussphaericus的氨基酸脱氢所述亚胺还原酶为来源于Streptomycessp或Bacilluscereus的所述酮还原酶为来源于Sporobolomycessalmonicolor的酮还原酶或者Acetobactersp.所述烯还原酶为来源于Chryseobacteriumsp.CA49或SewanellaoneidensisMR_1的所述单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶，或来源于Rhodococcusruber_SD1的环sp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEOIDN的环己酮单加氧酶为具有SEOIDNO：4序列或SEOIDNO：5序列的突变体；所述来源于所述乳酸脱氢酶为来源于Lactobacillushelveticus的D_所述甲酸铵脱氢酶为来源于Candidaboidinii的所述葡萄糖脱氢酶为来源于LysinibacillussphaericusG10的葡萄糖所述醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobiumbrockii3所述非共价的方式固定于所述活化载体上是指通过PEI以离子吸附的方式吸附于所述向所述初固定化酶中添加PEI至所述PEI的终浓度为0.5w/v5w/v得到PEI一初固通过对所述初固定氨基酸脱氢酶进行PEI表面包覆的方式，进而将所述GDH或所述FDH通过对所述初固定亚胺还原酶进行PEI表面包覆的方式，进而将所述GDH或所述FDH进通过对所述初固定酮还原酶进行PEI表面包覆的方式，进而将所述GDH或所述FDH进行通过对所述初固定烯还原酶进行PEI表面包覆的方式，进而将所述GDH或所述FDH进行4通过对所述初固定环己酮单加氧酶进行PEI表面包覆的方式，进而将所述GDH或所述20.权利要求1至9中任一项所述的共固定化酶，或者权利要求10至19中任一项所述的共固定化酶的制备方法所制备的共固定化酶在生物催化反应5不同的。比如Bolivar等(Biomacromol.2006,7,669_673)研究了来自假单胞菌SP101的FDH的酶被证明是具有很高的热稳定性、pH稳定性并且在具有增强的稳定性情况下具有超过[0005]Kimetal(J.Mol.CatalB:Enzy97(2013)209–214)报道了使用交联酶聚集体(CLEA)的方法来固定来自Candidaboidinii.的甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FDH)，并认为葡聚糖多醛(dextranpolyaldehyde)作为交联剂代替戊二醛糖多醛形成的交联酶聚集体(Dex_CLEA)的热稳定性比游离酶的热稳定性提高了3.Candidamethylica的FDH的固定化酶。FDH共价固定到环氧活化Immobead150载体上，Immobead150载体先经过乙二胺(ethylenediamin)修饰，然后依次经过戊二醛活化[0007]Jackon等(Pro[0008]也有些报道了两种酶的共固定化，比如Valikhani等(Biotech.Bioengg.2018；115:2416–2425)报道了细胞色素P450单加氧酶(色素P450s)发表了共固定化的Baeyer_Villiger单加氧酶(BVMO)和葡萄糖脱氢酶用于ε_己内酯衍生物的合成。将来自Thermocrispummunicipale的热稳定环己酮单加氧酶(TmCHMO)与来自6Thermoplasmaacidophilum的葡萄糖脱氢酶(GDH)(GDH_Tac)共固定化到氨基官能化琼脂[0012]进一步地，转氨酶为来源于B.thuringiensis或VibriofluvialisstrainJS17原酶；优选地，酮还原酶为来源于Sporobolomycessalmonicolor的酮还原酶或者Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶，更优选地，来源于Acetobactersp.CCTCC加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于BrachymonasIDNO：5序列的突变体；来源于Rhodococcusruber_SD1的环己酮单加氧酶为具有SEOID78定化酶的制备方法所制备的共固定化酶在生物催化反应在连续化的生物催化反应中的循环利用次数为49选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus或Bacillusspha酮还原酶为来源于Sporobolomycessalmonicolor的酮还原酶或者Acetobactersp.CCTCCsp.CA49或SewanellaoneidensisMR一1的烯还原酶；优选地，单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体，更优选地，氨基树脂载体选自如下任意一种：离子吸附的方式固定于氨基树脂载体上。此处第一酶是指对共固定化过程中的某些试剂，高使用次数可达20～25次；单加氧酶CHMO_Rs与GDH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA，最高使用次数达13次，单加氧酶CHMO_Rs与ADH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA，最高使用次数达13～15次，共固定化至ECR8409载体，最高使用次数达16次；最高使用次数达21次；ERED_Chr最优比例下固定化至载体LX1000EPN，最高使用次数达21[0066]在本申请第二种典型的实施方式中，提供了上述任一种待固定的辅酶吸附于载体上，具体所添加的PEI的量可以根据实际需要进行合理调整。将包括一步固定法或分步固定法。一步固定法是通过将不同组合的两种辅因子与转氨酶混酸脱氢酶；通过对初固定氨基酸脱氢酶进行PEI表面包覆的方式，进而将GDH或FDH进行固[0083]上述各种主酶及其辅酶的共固定化的制备方法中，PEI包面包覆的方式与前述向[0106]用4～5mL0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤1g氨基树脂，用4mL0.1M磷酸缓冲液[0107]将含有100～120mg蛋白质的4mL酶溶液(调节适当比例的TA和LDH)加入到戊二醛[0108]通过用硼氢化物还原亚胺双键可以实现更稳定的连接。将1g固定化酶用4mL缓冲[0109]TA和LDH的共固定化活性测试，通过利用游离的FDH来实现NADH的再生进行测度为25(w/v)50(w/v)％的戊二醛水溶液滴加入重悬液中使戊二醛的终浓度为2(w/120mg蛋白质的4mL酶溶液(调节适当比例的TA和LDH和FDH)加入到戊二醛活化树脂中，在[0121]5mL的0.1MPB(pH8.0)装入10ml的反应器中，随后通过加入100mg上述底物1、[0128]5mL的0.1MPB(pH8.0)装入10ml的反应器中，随后通过加入100mg上述底物1、5mgNADP+的0.1MPB(pH8.0)及100_200mg的CHMO与ADH的共固定化酶(湿的，含有50~量浓度为2550％的戊二醛水溶液滴加入重悬液中使戊二醛的终浓度为2％。在20℃温[0151]将5mL0.1MTris_Cl缓冲液(pH8.0_9.0)加入10m[0153]将5mL0.1MTris_Cl缓冲液(pH8.0_9.0)加入10m[0179]将2mL0.1MPB缓冲液(pH7.0_8.0)加入10mL反应器中，然后加入100mg上[0191]使用同实施例9的共固定化酶，200mL反应器中加入50g转氨酶TA_Bt与辅酶LDH,[0193]以0.8mL/min的速度向连续搅拌罐中连续％～9997过将上述主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上，实现了这些主酶及其辅酶的共固定化，15<213>酮还原酶(Acetobactersp.)<213>酮还原酶(Acetobactersp.)<213>环己酮单加氧酶(Rhodococcussp.Phi1)<223>F508Y+F435N+L438A+T436S+F<213>环己酮单加氧酶(Rhodococcussp.Phi1)<223>F508Y+F435N+L438A+T<213>环己酮单加氧酶(Rhodococcussp.Phi1)15