达格列净片溶出方法的研究

I达格列净片溶出方法的研究摘要对达格列净片中的溶出度方法进行了系统适用性、专属性、准确度、溶液稳定性、线性及范围等方面的验证。系统适用性试验表明：达格列净对照品溶液连续进样6次保留时间和峰面积的RSD均小于2%，系统稳定。滤膜吸附试验表明：滤膜对溶出度检测无干扰。专属性试验表明：空白溶剂、空白辅料对检测无干扰。线性试验表明：样品浓度在0.593～23.711μg/ml具有良好的线性关系，r=1.0000。准确度试验表明：本方法回收率在98.0～102.0%之间，符合要求。溶液稳定性结果表明：本品溶液在23.5小时内稳定。高效液相色谱法适用于达格列净溶出度的检测。关键词：达格列净片；溶出度；高效液相色谱法StudyonDissolutionMethodofDaGeLieJingPianAbstractInthispaper,thedissolutionmethodofDaGeLieJingPianwasverifiedintermsofsystemapplicability,specificity,accuracy,solutionstability,linearityandrange.ThesystemsuitabilitytestshowedthattheRSDof

retentiontimeandpeakareaofsixconsecutiveinjectionswaslessthan2%,andthesystemwasstable.Theresultsofmembraneadsorptiontestshowthatthemembranehasnointerferenceondissolutiondetection.Thespecificitytestshowedthattheblanksolventand

theblankexcipienthadnointerferencetothedetection.Thelineartestshowsthatthesampleconcentrationisintherangeof0.593to23.711μg/mlwithagoodlinearrelationship,r=1.0000.Theaccuracytestshowsthattherecoveryofthismethodisbetween98.0~102.0%,whichmeetstherequirements.Theresultsof

Solutionstabilityshowedthatthesolutionwasstablein23.5hours.Thismethodissuitableforthedetermination.Keywords:DaGeLieJingPian;Dissolutionrate;HighPerformanceLiquidChromatography前言达格列净片为中国获得首个批准钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂，是治疗2型糖尿病的药品。钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)存在于近端肾小管上皮细胞,在肾脏血糖的重吸收中发挥重要作用,因此选择性抑制SGLT2活性,从而特异性抑制肾脏对葡萄糖的重吸收,增加尿糖排泄可以达到降糖目的[1～17]。达格列净片是速释的薄膜包衣片，适用在有2型糖尿病成人中作为辅助饮食和运动改善的血糖控制，一天一次，一次10mg[18]。2014年的国际糖尿病联盟报告显示，2型糖尿病患者占到糖尿病总患者的百分之九十[19]。在2017年３月13日，国家食品药品监督管理总局正式批准阿斯利康旗下的糖尿病治疗创新药达格列净片可作为单药治疗用于２型糖尿病成人患者改善血糖控制，因此达格列净片成为在我国首个上市的钠－葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂[20～23]。达格列净片从上市以来治疗2型糖尿病的疗效显著得到了国际的认可，糖尿病患者愿意服用这个药品，使得许多研发机构对其进行开发。目前公司对达格列净片的溶出方法在不断研究中，为增加临床上治疗的选择性，对其进行溶出方法系统适用性、专属性、准确度、溶液稳定性、线性及范围等方面的验证。1、仪器与试剂达格列净片溶出度检查涉及到的仪器、试剂和样品信息为：电子天平（梅特勒：AB135-S；上海越平：FA2004）、紫外仪（北京普析通用：TU-1810）、高效液相色谱仪（日本岛津：LC-10A/LC-15C；安捷伦：1260）、色谱柱（UltimateXB-C18、AgelaInnovalC18；250×4.6mm，5μm）；磷酸二氢钾（分析纯；北京化工厂）、氢氧化钠（分析纯；北京化工厂）、盐酸（分析纯；北京化工厂）、冰醋酸（分析纯；北京化工厂）、醋酸钠（分析纯；北京化工厂）、甲醇（色谱纯；彪仕奇）、水（纯化水）；达格列净市售制剂5mg（3H64431；百时美施贵宝Bristol-MyersSquibb）、达格列净市售制剂10mg（3F77113；百时美施贵宝Bristol-MyersSquibb）、达格列净精制品（130202；自制）、达格列净片小试批5mg（130808；自制）、达格列净片小试批10mg（130809；自制）、达格列净片中试三批5mg（131001、131002、131003；自制）、达格列净片中试三批10mg（131004、131005、131006；自制131004、131005、131006）。2、达格列净溶出度检查条件选择达格列净片属于BCS分类系统中第III类，高溶解低渗透型。溶出度检查并非药物吸收的限速步骤。研究可知本品在多种的介质中溶出的速度比较快，由此本品溶出行为较好。2.1溶出度检查方法的选择本品的规格比较小，溶出度的浓度比较低，采用紫外法不合适，因此选择液相法对溶出度进行检查。溶出度检查色谱条件采用含量测定项下的色谱条件，具体为：照高效液相色谱法[24]（中国药典2010年版二部附录VD）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（70∶30）为流动相，流速为每分钟1.0ml，检测波长为223nm。进样量为50µl。2.2温度选择模拟体温应控制溶出温度在37℃±0.5℃。2.3溶出曲线测定取样点的选择根据一般制剂溶出度测定时间点的要求，本方法设计在5min、10min、15min、20min、30min、45min、60min取样测定。2.4转速的筛选本品为片剂，片剂优先选择浆法，浆法常用转速为50转和75转；对比达格列净市售片在这两种转速下累积溶出曲线。通过转速的筛选浆法50转对于糖尿病患者来说是最适合的，对于一个质量好的药品应该在一定pH范围内出现溶出和释放，这样药品进入人体内会发挥更好的疗效。结论：本品在75转/min溶出较快，10min达到溶出平台。50转/min相对较慢，两种转速下在15min溶出度均大于85%，优先选择低转数50转/min。3、达格列净溶出度方法的拟定达格列净含量方法主峰保留时间适中，溶出度的色谱条件拟定和含量一致。取本品，照溶出度测定法[25]（中国药典2010年版二部附录ⅩC第二法），分别以pH4.5的醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、水、0.1mol/L盐酸各900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，经5、10、15、20、30、45、60分钟时，取溶液适量，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取达格列净对照品约11mg，置100ml量瓶中，加甲醇10ml使溶解，用溶出介质稀释至刻度，摇匀。精密量取适量，用溶出介质定量稀释制成每1ml含5.6μg（5mg规格）或11μg（10mg规格）的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法[24]（中国药典2010年版二部附录VD）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（70∶30）为流动相，流速为每分钟1.0ml，检测波长为223nm。精密量取上述两种溶液各50µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各时间点的累积溶出量。4、达格列净溶出度检查及溶出行为一致性评价0.1mol/L盐酸溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH4.5醋酸盐缓冲液、水介质。在以上四种溶出介质中分别测定市售制剂（5mg、10mg规格）各时间点的累积溶出度，绘制溶出曲线。市售制剂5mg、10mg规格在溶出介质中溶出速度均比较快。15min溶出量均达到85%以上。4.2考察5mg（批号：130808）和10mg（批号：130809）规格自制制剂在0.1mol/L盐酸、pH6.8缓冲液、pH4.5缓冲液、水溶液四种介质中的溶出行为，绘制溶出度曲线。自制制剂在溶出介质中溶出的速度均比较快。15min溶出的量均达到85%以上。4.3以市售制剂为参比制剂，对自制制剂在不同介质中与市售制剂的溶出相似性进行对比。结论：自制制剂、市售制剂在15min溶出量均大于85%，无需进行ƒ2因子对比，即认为两者溶出行为基本一致。自制制剂在四种不同的溶出介质中与市售制剂溶出的曲线基本一致，溶出的行为也基本一致。研究者申报新晶型原料无水无丙二醇的达格列净所制成的制剂溶出行为与原研的一致，更换晶型后对溶出度无影响。5、溶出介质选择通过上述研究可知：本品在溶出介质中溶出速度比较快，15min溶出的量均大于85%。最终选择pH4.5醋酸盐缓冲液作为溶出度介质。并进行详细的方法学验证。6、溶出方法学验证6.1系统适用性对照品溶液：取达格列净对照品约11mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml使溶解，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为5mg对照品溶液。精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为10mg对照品溶液。然后需要精密量取对照品溶液之后在液相色谱仪中连续进样，观察并记录。结论：由结果可知，达格列净对照品溶液连续进样5次，其保留时间和峰面积的RSD均小于2.0%，理论板数较高，表明该色谱条件下系统稳定，适合溶出度的检查。6.2准确度按100%溶出浓度的50%、80%、100%设计实验，并按100%浓度的处方量加入辅料，进行本品溶出度的回收率试验。结论：本方法测得本品3个浓度9份样品回收率结果均在98.0%～102.0%范围内，且9份样品回收率结果的RSD小于2%，表明本方法的准确度良好。6.3专属性空白介质：pH4.5醋酸盐缓冲液空白辅料溶液：10mg规格和5mg规格准确度项下的空白辅料溶液。供试品溶液：准确度试验项下的5mg规格样品和10mg规格样品的100%供试品溶液。然后需要精密量取空白介质、空白辅料溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪中，观察并记录。结论：空白介质及空白辅料对达格列净溶出度检查无干扰。6.4线性及范围达格列净片剂的规格分别为5mg和10mg，溶出度的浓度分别为5.6μg/ml和11μg/ml。线性试验浓度应涵盖溶出度的两个浓度点。线性范围设计：按10mg规格样品的100%溶出浓度（11μg/ml）的5%、10%、20%、40%、50%、80%、100%、200%设计试验。线性试验溶液：分别精密量取达格列净贮备液适量，用溶出介质稀释制成含达格列净为22μg/ml、11μg/ml、8.8μg/ml、5.5μg/ml、4.4μg/ml、2.2μg/ml、1.1μg/ml、0.55μg/ml、的溶液。然后需要精密量取线性试验溶液之后注入液相色谱仪，观察并记录。结论：达格列净在0.593～23.711μg/ml浓度范围内，具有良好的线性关系，线性方程回归系数为1.0000。6.5耐用性项下溶液稳定性5mg规格、10mg规格供试品溶液：取本品1片，以pH4.5醋酸盐缓冲液900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依照方法进行操作，经过30分钟时，取适量溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。然后需要将供试品溶液放置在室温下，之后在不同的时间段内注入液相色谱仪，观察并记录。结论：室温条件下放置23.5RSD小于2%，表明该溶液供试品溶液：取130808批本品1片，以pH4.5醋酸盐缓冲液900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依照方法进行操作，经过60分钟时，取适量的溶液，依次采用微孔滤膜过滤和离心两种方式进行处理。分别精密量取50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。比较峰面积的变化。结论：本品溶出液分别采用离心和微孔滤膜两种方式处理后，峰面积无明显变化。采用聚醚砜和聚四氟乙烯材质的滤膜进行滤过，峰面积无影响，说明滤膜对溶出度检查无干扰。7、7.1采用pH4.5缓冲液对本品5mg规格中试三批样品进行溶出度检查，分别在七个不同的时间段进行取样测定并绘制溶出曲线。中试三批样品重现性较好，处方工艺稳定性好。中试三批与市售制剂，溶出行为相似。7.2采用pH4.5缓冲液对本品10mg规格中试三批样品进行溶出度检查，分别在5min、10min、15min、20min、30min、45min、60min取样测定并绘制溶出曲线。中试三批样品重现性较好，处方工艺稳定性好。中试三批与市售制剂，溶出行为相似。7.3中试三批5mg和10mg规格在不同介质中溶出行为一致性评价以市售制剂为参比制剂，对中试131001、131004批在不同介质中与市售制剂的溶出相似性进行对比。结论：中试制剂（5mg规格、10mg规格）、市售制剂在15min溶出量均大于85%，无需进行ƒ2因子对比，即认为两者溶出行为基本一致。中试制剂在四种溶出介质中与市售制剂溶出的曲线一致，溶出行为基本一致。研究者申报新晶型原料无水无丙二醇的达格列净所制成的制剂溶出行为与原研的一致，更换晶型后对溶出度无影响。7.45mg和10mg规格自制测定结果根据溶出度的条件对市售制剂、自制制剂5mg和10mg规格样品进行检查，批号：131001（5mg规格）的溶出度为98.26%、100.1%、98.70%、98.65%、98.24%、99.30%。批号：131002（5mg规格）的溶出度为99.13%、99.36%、97.77%、98.49%、99.23%、98.10%。批号：131003（5mg规格）的溶出度为98.51%、98.91%、98.64%、98.57%、99.78%、99.60%。市售制剂（5mg规格）的溶出度为102.5%、94.26%、101.4%、98.87%、100.6%、101.2%。批号：131004（10mg规格）的溶出度为99.64%、101.3%、99.74%、102.1%、101.6%、99.83%。批号：131005（10mg规格）的溶出度为101.5%、100.2%、101.7%、99.47%、100.5%、101.3%。批号：131006（10mg规格）的溶出度为100.6%、99.05%、100.0%、100.6%、99.82%、100.8%。市售制剂（10mg规格）的溶出度为91.01%、97.66%、96.99%、93.81%、95.16%、94.77%。中试三批5mg和10mg规格制剂的溶出度及市售的溶出度均符合限度要求。因此，本法适用于达格列净片溶出度的检测。参考文献[1]张富东,李玲.新型抗2型糖尿病药物钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂研究进展[J].国外医学(药学分册),2011(5):375-380.[2]张富东,李玲.新型抗2型糖尿病药物钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂研究进展[J].国际药学研究杂志,2011,38(5):375-380.[3]朱蕾,杨怡.钠-葡萄糖协同转运蛋白与糖尿病[J].国际内分泌代谢杂志,2011,31(6).[4]袁璐,李倩,高谷,马建华.钠葡萄糖协同转运子2抑制剂:糖尿病治疗的新选择[J].国际内分泌代谢杂志,2010,30(5).[5]胡丽.SGLT2抑制剂药物的研究进展[J].医学综述,2011,17(24):3782-3785.[6]谢少斐,张凤逸,邹珊,黄海燕,李纬.已上市钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂临床药动学特点比较[J].中国现代应用药学,2016,33(4):517-520.[7]安秀敏,缪珩.SGLT2抑制剂降低糖尿病患者心血管风险的研究进展[J].国际内分泌代谢杂志,2017,37(4).[8]付丽坤,姜晓艳.SGLT2抑制剂治疗2型糖尿病的相关研究[J].国际内分泌代谢杂志,2012,32(2).[9]吴丹,刘建英.SGLT2抑制剂对2型糖尿病患者骨骼的影响[J].中国骨质疏松杂志,2018(4):538-542.[10]杨哲普,毕会民.恩格列净与DDP4抑制剂治疗2型糖尿病疗效比较的Meta分析[J].医学研究杂志,2017,46(4):116-123.[11]陈再新,刘雯,张明光,蒋晓勤,吉小龙.新型2型糖尿病治疗药物SGLT-2抑制剂的临床研究进展[J].江苏工业学院学报,2014,26(4):37-44.[12]赵岚,王玲.基于心血管获益浅谈SGLT-2抑制药在2型糖尿病管理中的价值[J].中国药师,2019(12):2259-2262.[13]李明政,吕凌波.达格列净联合比格列酮治疗2型糖尿病的临床研究[J].现代药物与临床,2019,34(7):2160-2163.[14]董丽梅,罗宏丽,杨婷,王国俊.Ipragliflozin治疗2型糖尿病的Meta分析[J].重庆医学,2017,46(29).[15]韦佳琛,李嫚,张渭涛,何旺,郝姝.达格列净联合二甲双胍治疗2型糖尿病的临床疗效[J].现代药物与临床,2018,41(8):1486-1489.[16]JAMESLP,MAYEUXPR,HINSONJA.Acetaminophen-inducedhepatotoxicity[J].DrugMetabDispos,2003,31(12):1499-1506.[17]ZHAOY,FANG