基因治疗知识讲座

基因治疗分类体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代

1973年第一例人体实验

1978年第二例基因治疗实验基因治疗动物实验广泛开展

DrAnderson（1980）首先阐明基因治疗前景和发展方向

Rosenberg（1990）利用逆转录病毒将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），并将TIF输回体内，TIF集中在肿瘤部位，表达neoR。

1990年9月14日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行

（美国，世界上开展基因治疗最早的国家）大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：体外试验和动物试验

I期临床试验——6---10名志愿者

II期临床试验——20---30名志愿者

III期临床试验——充分分析疗效、安全性

中国

1991年7月开始进行基因治疗试验

一、基因治疗的策略TheStrategyofGeneTherapy

（一）基因置换（genereplacement）

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。又称为基因打靶(genetargeting）定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。基因置换必要条件：1、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害（二）基因添加

基因添加或称基因增补（geneaugmentation）:

通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。基因干预(geneinterference)

指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。反义核酸：封闭基因表达核酶：裂解特异的靶mRNARNA干涉技术：（三）基因干预（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。自杀基因的作用机制

☻TK/GCV

单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。☻CD/5-FC大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自杀基因系统5-氟尿嘧啶通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。

旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

2.旁观者效应（五）基因免疫治疗

通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。基因修饰肿瘤细胞的疫苗疗法基因修饰TIL的过继免疫疗法免疫增强基因疗法原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法二、基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚；要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；外源基因可有效导入靶细胞外源基因能在靶细胞中长期稳定存留导入基因能适量表达导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害理想的基因治疗还必须：二、基因转移技术

TheTechniqueofGeneTransfer基因治疗的两种途径载体目的基因invivoexvivo靶细胞

基因治疗途径1、间接体内治疗途径（exvivo）将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、药物处理或其他操作后，再输回患者体内（安全、易控制但操作复杂）2、直接体内治疗途径（invivo）

将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）

基因转移(genetransfer)技术：

1.病毒介导的基因转移系统。

2.非病毒介导的基因转移系统。

1.病毒介导的基因转移系统

病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。Retrovirus

（1）逆转录病毒

（1）两端各有一长末端重复序列LTR。

逆转录病毒前病毒的结构特点

（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。(1)在U3内有增强子和启动子；

(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。

（3）病毒有三个结构基因(1)gag基因，编码核心蛋白及属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

逆转录病毒前病毒的结构特点

（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。

逆转录病毒前病毒的结构特点

构成逆转录病毒介导的基因转移系统

——逆转录病毒载体由两部分组成：(1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因(2)辅助细胞株(如PA317)：它由缺陷型逆转录病毒感染构建而成RetroviralpackagingsystemLTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系LTRLTR靶细胞目的基因标记基因LTRφLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒

逆转录病毒载体的特点

①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。

逆转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。

（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

腺病毒宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。腺病毒的优点1.基因导入效率高，对人类安全；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因；

腺病毒载体缺点4.靶向性差。

1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。（3）腺病毒相关病毒载体（AVV)腺病毒相关病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAVVirusParticlesStructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因AAV的特点●以潜伏感染为主；●病毒基因组与细胞共存；●只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；●若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；●产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。

AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。

AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。

AAV载体的缺陷：

AAV载体容量小，目前最多只能容纳5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。

2.非病毒载体介导的基因转移系统

（1）脂质体介导的基因转移技术

脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。

基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导法缺点：脂质体介导进入靶细胞内，易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。

（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。缺点：受体介导的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。受体介导转移技术示意图

（3）基因直接注射技术

不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。

1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；

2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；

3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。

基因直接注射法的优点1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。

三、基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：1.容易取出和移植。血液系统的细胞、成纤维细胞、成肌细胞；2.细胞具有较长的寿命3.离体细胞较易受外源基因转化4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活体细胞生殖细胞目前常用的靶细胞有：1.造血细胞2.皮肤成纤维细胞3.肝细胞4.血管内皮细胞5.淋巴细胞6.肌肉细胞7.肿瘤细胞三、基因干预

GeneInterference主要干扰特定细胞的mRNA转录和翻译基因干预的种类：1.反义RNA(antisenseRNA)2.干扰RNA(RNAinterference)3.核酶(ribozyme)4.三链DNA技术

（一）反义RNA

1.反义RNA与基因表达调控利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。缺点：RNA易降解（2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用缺点：细胞内转录的反义RNA量不易控制

反义RNA的关键技术问题：☻专一性转移问题：如何解决某一组织、器官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题。

2.受体介导反义RNA转移技术

①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。

将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。

借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。

3.反义RNA的应用前景

受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。

（l）安全性高

（2）反义RNA设计和制备方便

（3）具有剂量调节效应

（4）能直接作用于一些RNA病毒

反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。

在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。（二）RNA干扰

1.RNA干扰现象

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。

2.RNA干扰的机制

RNA干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。

长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。A.贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构；RNA干扰机制示意图

3.RNA干扰的应用前景

RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。（三）核酶(ribozyme)用于基因治疗

天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。

在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）

1.核酶的设计

核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。

（1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。

（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。

在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。

核酶的作用机制

2.核酶的应用

与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

核酶导入细胞方法1、外源导入法：可以通过化学合成；也可以采用体外转录方法2、内源导入法：利用表达载体在细胞内转录产生核酶分子。（四）三链DNA

三链DNA在基因治疗中的意义寡聚脱氧核苷酸（ODN）以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止转录技术关键TFO的设计与合成专一性稳定性摄取与分布四、治疗基因的受控表达

RegulatedExpressionofTherapeuticGene

时间:

治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。

空间:表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。

1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；

2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。

是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产生毒副作用。

要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。☻使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件☻使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件（一）基因内部的调节机制

1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件

例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。

不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。

2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件

某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。

甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中表达很高，采用其启动子可以使治疗基因只在CEA阳性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。（二）基因外部的调节机制

除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。

采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达

病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。

例如，在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。

肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)和缺氧响应元件(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。

（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达

（四）治疗基因的诱导表达

采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与DNA结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。

四环素抗性操纵子系统原理四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。

五、基因治疗的应用研究TheApplicationofGeneTherapy腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略：淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的

5%-10%

维持免疫系统功能改善病人症状治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%

维持免疫系统功能,改善病人症状（一）遗传病的基因治疗研究

1.在DNA水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病