3.1 重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修3

1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。第3章基因工程

第1节重组DNA技术的基本工具

情境导入

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。大量施用农药？×

能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？抗虫基因转基因基因工程

苏云金杆菌中存在一种毒蛋白基因（Bt基因），编码出的毒蛋白能杀死害虫。

一、基因工程的理论基础

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。操作对象：操作水平：原理：结果：意义：基因（DNA）DNA分子水平基因重组创造出人类需要的新的生物类型和生物产品定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍水母的绿色荧光蛋白基因本质：基因在空间上转移并成功表达

一、基因工程的理论基础【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？①DNA分子的基本组成单位相同（4种脱氧核苷酸）；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。基因在空间上转移并成功表达DNA（基因）

转录翻译mRNA蛋白质

相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。

一、基因工程的理论基础思考：DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1.定义：2.来源：（限制酶不是一种酶，而是一类酶）3.种类：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。数千种4.作用：切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶（限制酶）主要是原核生物，可人工合成（蛋白质）根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？思考：

主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身安全的目的。为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

原核细胞内DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。①②

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”5.限制酶的识别序列：大多数限制酶的识别序列由

组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。6个核苷酸①都可以找到一条中心轴线；②中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。思考：四种限制酶识别的特定序列有何特点？

在切割部位，正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。拓展——限制酶的命名：阅读72页资料卡“限制酶的命名”，说说EcoRⅠ各个字母的代表含义。EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”6.切割结果:（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ识别序列为CCCGGG*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。切口处是平整的，这样的切口叫平末端。注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________

GATCAATTAGCTGATC思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）不能，限制酶只能识别并切开双链DNA分子。（2）限制酶切一次可断开

个磷酸二酯键，产生

个游离的磷酸基团，产生

个黏性末端。要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？222（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？【练习2】请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”【练习3】把两种来源不同的DNA分子进行拼接，应该怎样处理呢？用同种限制酶切割(EcoRⅠ)TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA缺口怎么办完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。DNA连接酶—“分子缝合针”恢复被限制酶切开的磷酸二酯键

二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

三、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用：将双链DNA片段“连接”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。注意：氢键的形成不需要酶的催化5′3′TACGTACTGAAT5′3′5′3′CGCGCG5′3′CGCGCG切口切口切口CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG注意：①DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!②DNA连接酶作用没有特异性!

三、DNA连接酶——“分子缝合针”2.类型：种类来源大肠杆菌T4噬菌体作用差别E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端效率相对较低【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？GAGTATCDNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATTCAATTDNA聚合酶思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

二者的作用都是催化磷酸二酯键的形成。DNA连接酶是在两个DNA片段间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键。

三、DNA连接酶——“分子缝合针”知识整合：几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶

DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链限制酶DNA连接酶解旋酶DNA聚合酶【练习4】以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（

）考点突破A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.②片段是在识别序列为

的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键如何将外源基因运入细胞呢？①④是由同一种限制酶切割而成的CGDNA连接酶D

三、DNA连接酶——“分子缝合针”2.怎样才能将Bt蛋白基因送入棉花细胞呢？1.能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？

游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”Bt蛋白基因5’3’3’5’

四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”将外源基因送入受体细胞,

在受体细胞内对目的基因进行大量复制。1.作用：2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别(必须选择DNA病毒)

四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.运载体需具备的条件：条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：对受体细胞无害。问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题1：载体要与目的基因连接，需要具备什么条件？如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因等

四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”最常用的载体——质粒其基因属于细胞质基因

一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNA复制的起始位点位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止转录便于重组DNA分子的筛选和鉴定。能控制表达所需要的特殊性状如：抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。一至多个限制酶切位点供外源DNA片段插入限制酶DNA连接酶载体①能自我复制或能整合到宿主DNA上②有一个至多个限制酶切割位点③有特殊的标记基因④对受体细胞无害质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：

E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）课堂小结

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定1.实验原理DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNADNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菜花和猪肝等。

（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）(1)选材：(2)试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用2.材料用具

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定取材研磨过

滤DNA析出DNA鉴定研磨液成分作用SDSEDTATris-HCl缓冲液称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。使蛋白质变性抑制DNA酶稳定DNA

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取材研磨DNA析出DNA鉴定破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量研磨效果好（有利于充分研磨）(4)如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？(1)研磨的目的：(2)研磨时间不宜太长：(3)有条件的可在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶是因为?过

滤称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。取材研磨过

滤DNA析出DNA鉴定方法一：在漏斗中垫上

过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。纱布上清液上清液问题1：过滤的纱布能用滤纸代替吗？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。问题2：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？可能含有RNA以及蛋白质、脂质、糖类等

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤DNA析出DNA鉴定取材研磨过

滤问题1：此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。问题2：酒精预冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。问题3：为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子在上清液中加入体积相等的

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤实验组对照组沸水浴加热DNA析出DNA鉴定取材研磨过

滤不加入丝状物加入丝状物将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入4mL二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤鉴定结果溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。4.结果分析与评价

五、探究实践：DNA的粗提取与鉴定二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。(1)提取出丝状物或沉淀物一定是白色的吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。

本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂