《畜禽繁殖技术》-第９章

９.１发情控制技术发情是母畜繁殖过程中的一个重要环节。所以,发情控制的目的是:打破季节性繁殖和生理及病理性乏情期;由单胎变多胎;由分散发情变集中发情;缩短繁殖周期、提高繁殖效能;实现繁殖的专业化,提高优秀种畜的利用率。发情控制技术包括:同期发情、诱导发情和超数排卵等。发情控制技术采用的手段:通常用激素处理。发情控制注意事项:一是科学的饲养管理是家畜正常繁殖的基本条件,任何繁殖技术的运用只能在这个前提下才会表现出应有的作用。二是在发情控制中,使用激素制剂务必有严谨的科学态度。下一页返回９.１发情控制技术９.１.１同期发情同期发情(ＥｓｔｒｕｓＳｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ)是指利用某些激素制剂人为地使一群母畜能够在一个短时间内集中统一发情,并能排出正常卵子的技术,以便达到配种、受精、妊娠的目的。也就是人为地改变自然发情周期的规律,继而将发情周期的过程进行调整、统一,使得群体母畜在规定的时间内集中发情和排卵。１.同期发情技术在畜牧生产中的意义①可以更迅速而广泛地应用冷冻精液,推广人工授精技术。②便于合理组织大规模畜牧业生产,进行科学饲养管理。上一页下一页返回９.１发情控制技术③胚胎移植的重要环节。④提高繁殖力。２.同期发情的机理黄体期的结束是卵泡期到来的前提条件,相对高的孕激素水平,可抑制发情,一旦孕激素的水平降到低限,卵泡即开始迅速生长发育,并表现发情。因此,同期发情的核心是控制黄体期的寿命并同时终止黄体期,而引起一群母畜同时发情。在自然状况下,任何一群母畜,每个个体均随机地处于发情周期的不同阶段,如卵泡期或黄体期的早、中、晚各期均存在。上一页下一页返回９.１发情控制技术同期发情技术主要是借助外源性激素,有意识地干预母畜的发情过程,暂时打乱自然发情周期的规律,继而把发情周期的进程调整到统一的步调之内,也就是被处理的家畜卵巢按照预定的要求发生变化,使它们的机能处于一个共同的基础上。同期发情常采用两种途径:一是延长黄体期,给一群母畜同时施用孕激素药物,抑制卵泡的生长发育和发情,经一定时期后同时停药,由于卵巢同时失去外源性孕激素的控制,卵巢的周期黄体已退化,于是同时出现卵泡发育,最终引起母畜同时发情。上一页下一页返回９.１发情控制技术采用孕激素抑制母畜发情,实际上是人为地延长黄体期,起到延长发情周期、推迟发情期的作用。二是缩短黄体期,应用ＰＧＦ２α加速黄体退化,使卵巢提前摆脱体内孕激素的控制,使母畜缩短发情周期,于是在短时间内卵泡得以同时开始发育,从而使母畜同期发情(见图９－１、图９－２)。孕激素处理法,不但可用于正常周期性活动的动物,也可处理乏情动物。而ＰＧＦ２α法只适用于正常发情周期活动的动物。但其共同点是通过延长或缩短黄体期而导致动物体内孕激素水平迅速下降,最终达到调节卵巢功能的目的(见图９－３)。上一页下一页返回９.１发情控制技术３.用于同期发情的激素和使用方法应用于同期发情的药物,根据其性质大体可分３类:第１类抑制卵泡发育的制剂(如孕激素)。第２类是溶解黄体的制剂(如前列腺素)。第３类是促进卵泡发育、排卵的制剂(如促性腺激素)。前两类是同期发情的基础药物,第３类是为了促使母畜发情有较好的准确性和同期性,是配合前两类使用的药物。(１)抑制卵泡发育的制剂如孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、炔诺酮、氯地孕酮、１８甲基炔诺酮等。它们能够抑制垂体ＦＳＨ的分泌,延长黄体期,因而间接地抑制卵泡发育和成熟,使母畜不能发情。上一页下一页返回９.１发情控制技术这些药物的用药期通常短于或者相当于一个正常发情周期的时间,其用药方式有以下几种。①阴道栓塞法。将泡沫塑料、棉团经灭菌后,浸吸一定量药液,塞于子宫颈附近,药液不断被阴道黏膜所吸收,再经过一定时间后取出。通常用于牛、羊,不宜用于猪。②口服法。每日将一定量的药物均匀拌在饲料内,以单个饲喂较为准确,经一定时间后同时停药。这种方法可用于舍饲母畜,但较费时费工,用药量大,且个体摄取剂量不准确。③注射法。每日将定量药物作皮下或肌肉注射,经一定时期后停止给药。此法剂量准确,但操作麻烦。上一页下一页返回９.１发情控制技术④埋植法。将成形的药剂或装有药物的带孔容器,埋植于皮下组织,经一定时间后取出。埋植期间药物被缓慢吸收。(２)溶解黄体的制剂在同期发情处理中,ＰＧＦ２α具有明显的溶解黄体作用,所以只能用于正处于黄体期的母畜。猪在发情周期第１０ｄ前,对前列腺素不敏感,牛、羊和马在发情周期５~１６ｄ以内的黄体对前列腺素都易产生反应。采取子宫内灌注法的效果优于肌肉注射法。经前列腺素处理后的群体母畜,一般在２~４ｄ后有７５％左右的母畜集中表现发情,但在群体中总有２５％左右的母畜正处于非黄体期,这部分母畜不能同期发情。上一页下一页返回９.１发情控制技术如果要使全群母畜同期发情,可在第一次使用前列腺素处理后１１ｄ,再用前列腺素处理一次。(３)促进卵泡发育、排卵的药剂在使用同期发情药物的同时,如果配合使用促性腺激素,可以增强发情同期化和提高发情率,并促使卵泡更好地成熟和排卵。常用药物为ＰＭＳＧ、ＨＣＧ、ＦＳＨ、ＬＨ及ＧｎＲＨ等。使用孕激素作同期发情处理后,第１次发情的受胎率往往较低,但第２次发情的受胎率即趋正常。这是由于孕激素能影响精子在母畜生殖道内的运行和生活力。因此,在孕激素停止施药后,立即配合应用ＰＭＳＧ,将会提高受胎率。上一页下一页返回９.１发情控制技术９.１.２诱导发情诱导发情(ＩｎｄｕｃｅｄＥｓｔｒｕｓ)是指动物在生理性或病理性乏情期内,借助外源激素如促性腺激素、溶黄体激素或某些生理活性物质如初乳以及环境条件的刺激,通过内分泌和神经作用,激发卵巢活动,促使卵巢从相对静止状态转变为机能性活跃状态,从而促使卵泡的正常生长发育,以恢复动物正常发情与排卵的一种技术。１.季节性乏情(１)生殖激素处理上一页下一页返回９.１发情控制技术在非发情季节,对乏情羊用孕激素处理６~９ｄ,在停药前４８ｈ按每千克体重注射ＰＭＳＧ１５ＩＵ,同期发情率可达９５％以上,第一发情期受胎率约为７５％。应用ＦＳＨ或氯地酚亦可促使母羊发情排卵,做到两年产３胎,使奶山羊全年均衡发情。对母马注射雌激素,可以在一定程度使发情周期恢复,每日一次注射５~１０ｍｇ,连续１０~１５ｄ,总剂量为７５~１５０ｍｇ。据报道,在１０月至翌年２月给６０余匹母马应用雌激素处理后可恢复发情,或者将２０~２４ｍｇ的雌激素作皮下埋植,也可获得一定的效果,经输精可正常妊娠。上一页下一页返回９.１发情控制技术(２)光照处理绵羊是由长日照过渡到短日照后开始表现发情的家畜。春、夏季是母羊的非发情季节,在此期间利用人工暗室,逐渐缩短光照时间,仿效秋季的光照时间,可以使大部分母羊表现发情。母马在非发情季节内,应用延长光照的办法可以促进卵巢机能的提早恢复。在马厩内离地面２.５ｍ高处悬挂２００~４００Ｗ的灯泡,从日落开始延长５~６ｄ的光照时间,母马的卵巢机能可以在翌年１月下旬到２月中旬得以提前恢复,表现出正常发情,比不做光照处理的母马早６５~８０ｄ开始发情。对公马,每天用４００Ｗ灯光做长光照处理,也可以得到和母马同样良好的效果,使精液品质正常。上一页下一页返回９.１发情控制技术(３)公畜刺激在与公羊隔离的母羊群里,于发情季节到来之前,如将公羊投放入母羊群里,则会使母羊提前发情,提早母羊的配种季节(公羊效应)。同样,公猪、公牛效应均能刺激母畜提早发情配种。２.哺乳期乏情母牛可在产后２周开始采用孕激素作预处理约１０ｄ后,再注射ＰＭＳＧ１０００ＩＵ,即可诱导发情;也可肌肉注射牛初乳２０ｍＬ,同时注射新斯地明１０ｍｇ,发情母牛配种时再注射ＬＨ－ＲＨ１００ＩＵ,可诱发８０％~９０％母牛发情排卵。上一页下一页返回９.１发情控制技术母猪哺乳期通常不发情,因此常采用早期断奶法诱导发情。哺乳母猪１个月断奶,断奶后母猪可在１周内发情。如果在断奶时注射ＰＭＳＧ效果更好,可大大缩短繁殖周期,做到２年５胎。产后１个月以上的泌乳山羊在耳后皮下埋植６０ｍｇ的１８炔诺酮药管维持９ｄ,在取出药管前４８ｈ,肌肉注射ＰＭＳＧ１５ＩＵ/ｋｇ体重,同时肌肉注射溴隐亭２ｍｇ/只,间隔１２ｈ再注射一次,发情以后静脉注射ＧｎＲＨ１００ＩＵ/只,诱发发情率达９０％以上。３.病理性乏情(１)卵巢机能减退上一页下一页返回９.１发情控制技术此病多发生于气候寒冷、营养状况不良、使役过度的母畜或高产奶牛。可用促性腺激素作辅助治疗。(２)持久黄体给予前列腺素可溶解黄体,停止孕激素的分泌,促使卵泡生长发育。诱导发情有别于同期发情:前者针对乏情的个体使之发情。后者针对周期性发情各阶段的群体,希望在预定的日期而且在相当短的时间内(２~３ｄ)集中发情,也叫群集发情。９.１.３超数排卵上一页下一页返回９.１发情控制技术超数排卵(Ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ)是指应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育,并排出具有受精能力的卵子的技术,简称“超排”。超排是进行胚胎移植时,对供体母畜必须进行的处理,其目的是为了得到较多的胚胎;诱使单胎家畜产双胎。１.理论依据在发情周期的末期,卵巢上的卵泡正处于开始发育时期,也就是黄体处于退行性而卵泡处于进行性交替变化的关键时期,这时使用适当剂量的促性腺激素处理,提高体内促性腺激素水平,可使卵巢内的多个卵泡同时发育、成熟、排卵。一次排出自然状况下十几甚至几十倍的卵子。上一页下一页返回９.１发情控制技术２.超排处理方法(１)药物和剂量ＰＭＳＧ制剂:随着ＰＭＳＧ的剂量增大,卵巢的反应亦会增强,发情提前。但过大剂量的激素其超排效果不稳定,如注射剂量超过３０００ＩＵ,并不能增加母牛的排卵数,反而易引起卵巢囊肿(见表９－１)。由于ＰＭＳＧ在体内半衰期较长,一般母牛使用剂量为２０００~３０００ＩＵ,做一次肌肉注射。使用ＰＭＳＧ做超排处理效果良好,药效比较稳定,卵巢体积不会过度增大,处理后卵巢容易恢复正常,排卵率高,残余的成熟卵泡少。上一页下一页返回９.１发情控制技术ＦＳＨ制剂:ＦＳＨ在体内的半衰期较短,注射后在较短时间内便失去活性。因此,使用时需做分次注射。在母牛实验中,将总剂量为３０ｍｇ和５０ｍｇ分配在３~４ｄ,每天注射２~３次,卵巢上出现的黄体数和回收胚胎数要比１ｄ只做一次注射或２ｄ做一次注射的超排效果好(见表９－２)。将ＦＳＨ和ＬＨ按５∶１的比例混合使用,也可取得良好效果。促排卵类药物制剂:经超排处理的供体,卵巢上发育的卵泡数要多于自然发情的卵子数,仅依靠内源性促排卵激素不能达到超排目的。因此,在供体母畜出现发情时,需要静脉注射外源性ＨＣＧ或ＧｎＲＨ、ＬＨ等,以增强排卵效果,减少卵巢上残余的卵泡数。上一页下一页返回９.１发情控制技术孕激素制剂:如用孕激素做超排预处理,可以提高母畜对促性腺激素的敏感性。(２)处理时期超排处理的时期应选择在发情周期的末期,即黄体消退时期。此时卵巢正处于由黄体期向卵泡期过渡。但在自然情况下,母畜的发情周期长短并非恒定不变,不但个体之间有差异,而且同一个体各次发情周期的时期也不一致。所以,在发情周期的后期用药物做超排处理,不一定能和卵巢机能的转变阶段相吻合。上一页下一页返回９.１发情控制技术用药物处理的时间如果是在黄体尚未临近消退阶段,或黄体已经消退、卵泡已明显发育并开始出现发情时,由于处理时间和卵巢机能发育的步调不相一致,效果往往不佳。为了获得良好的超排效果,必须在注射促性腺激素的同时,使卵巢上的黄体在一定时间内退化。如果在发情周期的中期进行处理,需要在使用促性腺激素后４８~７２ｈ配合注射ＰＧＦ２α,促使黄体消退(见图９－４、图９－５)。(３)提高反复进行超排处理的措施上一页下一页返回９.１发情控制技术超排应用的ＰＭＳＧ、ＨＣＧ、ＦＳＨ及ＬＨ均为大分子蛋白质制剂,对母畜做反复多次注射,体内会产生相应的抗体,使卵巢的反应逐渐减退,超排效果也随之降低。因此,对超排处理的要求,不仅包括第１次超排后的效果,而且还应考虑重复进行超排处理的效果。对于一头优良的供体母畜不仅能从一次超排处理中获得许多胚胎,更重要的是能否反复进行有效地超排处理,从而达到最大限度地提高供体繁殖力的目的。为此,需要采取如下措施。①增加药物的剂量:在第２次超排处理时,可加大促性腺激素的剂量,以保证正常的超排效果。上一页下一页返回９.１发情控制技术②间隔一定时期处理:母畜每进行一次超排处理,卵巢便经历一次沉重的生理负担,需经一定时期才能恢复正常的生理机能。所以,给供体母牛做第２次处理应距第１次６０~８０ｄ,第３次距第２次处理时间则需延长到１００ｄ以上。在每一次冲取胚胎结束后,应向子宫内灌注ＰＧＦ２α,以加速卵巢的恢复。③更换激素制剂:当连续两次使用同一种药物进行处理后,为了保持卵巢对激素的敏感性,可以更换另一种激素进行超排处理,以获得较好效果。(４)超数排卵的效果上一页下一页返回９.１发情控制技术①受胎率:凡进行超排处理排出的卵子的受精率一般低于自然发情排出的卵子。因此,回收时间应适宜,一般情况,随着排卵数的增加,其受精率和采胚率有下降的趋势。②排卵数:供体母畜一次超数排卵的数目不宜过多,两侧卵巢一次排卵为１０~１５枚为宜。否则,受精率下降,机能恢复所需时间长。对于多胎动物的排卵数可多一些。③发情率:应用促性腺激素和ＰＧＦ２α进行超排处理,大部分母牛有发情表现,也有少数虽无发情表现,却能正常排卵。上一页下一页返回９.１发情控制技术④发情时间和胚胎回收率:做超排处理注射ＰＧＦ２α后４８ｈ内发情的供体母牛胚胎回收率最高,７２ｈ后发情的供体母牛胚胎回收率明显下降,而且多为未受精卵。发情周期:超排后的母畜血液中含有高浓度的孕激素,因此发情周期将会延长。３.影响超排效果的因素(１)个体母牛在超排处理中,约有１/３的供体牛效果理想,有１/３的牛反应一般,而有１/３的牛效果甚差。有的个体对不同的促性腺激素反应不同。上一页下一页返回９.１发情控制技术(２)年龄与胎次青年母牛对超排药物敏感,所以排卵数和回收率高于经产母牛。(３)超排时间一般以发情周期第１０ｄ以后做超排处理效果理想。分娩后不久的母畜,不宜立即进行超排处理,一般需在４５~６０ｄ以后处理为宜。(４)品种如应用ＰＭＳＧ２０００ＩＵ进行超排处理,黑白花奶牛平均排卵５.３枚,西门塔尔牛１２.２枚,利木赞牛１６.４枚。上一页下一页返回９.１发情控制技术(５)季节母牛在２７℃以上,超排效果不理想。同时日照的长短对供体牛的激素分泌和受胎率也有明显的影响。(６)泌乳对泌乳期母牛的超排处理要优于干奶期母牛,但处于泌乳高峰期的母牛对ＰＭＳＧ不敏感。上一页返回９.２胚胎生物工程胚胎工程技术是胚胎移植技术发展到一定程度而出现的名词,是由发育工程演变而来的。胚胎工程技术根据其发展现状包括以下３类:胚胎移植技术、胚胎冷冻保存技术、性别控制技术,即Ｘ、Ｙ精子分离和胚胎性别鉴定技术、胚胎分割技术、试管动物技术(体外受精技术)、转基因动物技术、动物克隆技术(细胞核移植技术)、胚胎干细胞技术、胚胎嵌合技术。９.２.１胚胎移植１.概述(１)含义下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎移植(ｅｍｂｒｙｏｔｒａｎｓｆｅｒ,ＥＴ),即通常所说的“借腹怀胎”。就是将从雌性动物(供体)生殖道中取出的早期胚胎,或由体外受精等其他手段获得的胚胎移植到另一母体(受体)的生殖道中,使其继续生长发育,最终产下供体的后代。提供胚胎的个体称为供体,接受胚胎的个体称为受体。在畜牧生产中,家畜的超数排卵和胚胎移植通常结合应用,合称超数排卵胚胎移植技术(ＭｕｌｔｉｐｌｅＯｖｕｌａｔｉｏｎａｎｄＥｍｂｒｙｏＴｒａｎｓｆｅｒ),简称ＭＯＥＴ技术。胚胎移植技术是胚胎工程的基础,胚胎工程所有的技术成果最终都要通过胚胎移植实现。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程利用胚胎移植技术可以提高优良母畜的繁殖率,最大限度地发挥优良母畜在品种推广、改良和育种中的作用。(２)意义如果说人工授精技术是提高优良公畜配种效率的有效方法,那么胚胎移植则为提高优良母畜的繁殖力提供了新的技术途径,因此胚胎移植技术具有十分重要的意义。①充分发挥优良母畜的繁殖潜力。一则使优良供体省去很长的怀孕期,缩短繁殖周期;二则实行超数排卵,一次可获得更多的优良胚胎。②缩短世代间隔,加速育种进程。③提高生产效率。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程④代替种畜的引进。⑤保存品种资源。⑥有利于防治疫病。⑦提供研究手段。２.胚胎移植的生理学基础和基本原则(１)生理学基础母畜发情后生殖器官的孕向发育:大多数自发性排卵的家畜,发情后不论是否配种,或配种后是否受精,在最初一段时期(周期黄体期),生殖系统均处于受精后的生理状态下,在生理机能上,妊娠与未孕并无区别。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程这就给胚胎成功的移植和在受体内正常发育提供了理论根据。早期胚胎的游离状态:早期胚胎发育和子宫没有建立实质性联系,这便使其可以脱离活体而被取出成为可能。胚胎移植不存在免疫问题:受体母畜的生殖道(子宫和输卵管)对于具有外来抗原物质的胎盘和胎膜组织,在同一物种之内,无排斥现象。胚胎和受体之间可以建立有效联系,保证胎儿的正常发育。胚胎的遗传特性不受受体的影响。(２)胚胎移植的基本原则胚胎移植前后所处环境的同一性:上一页下一页返回９.２胚胎生物工程①供体和受体在分类学上的相同属性,即两者须属于同一物种。②动物生理上的一致性。即受体和供体在发情时间上的同期性,一般要求相差２４ｈ以内。③动物解剖部位的一致性。即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境相似性。(ａ)胚胎发育的期限。胚胎采集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命,最迟要在周期黄体退化之前数日进行移植。通常在供体发情配种后３~８ｄ收集胚胎,受体同时接受移植。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程(ｂ)胚胎的质量。胚胎不应受到任何不良因素(物理、化学、微生物等)的影响而危及生命力。必须经过鉴定确认为正常者。(ｃ)供、受体的状况。供体的生产性能、经济价值均须大于受体;两者均须健康无病。此外,还需强调的是胚胎移植只是空间位置的更换,而不是生理环境的改变,远比器官移植简单,但准确熟练的操作是必需的。３.胚胎移植的技术程序上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎移植主要包括供体和受体母畜的选择、供受体的同期发情、供体的超数排卵、供体的发情鉴定与配种、胚胎的收集、胚胎的检查与鉴定、胚胎的培养与保存以及胚胎移植等环节。见图９－６。(１)供体和受体的选择供体:供体应具有较高的育种价值,旺盛的生殖机能,对超排反应良好。受体:选择身体健康、繁殖机能良好、体形较大的母畜。头数应多于供体。(２)供体和受体的同期发情上一页下一页返回９.２胚胎生物工程同期发情常采用两种途径:一是延长黄体期,给一群母畜同时施用孕激素药物,抑制卵泡的生长发育和发情,经一定时期后同时停药,由于卵巢同时失去外源性孕激素的控制,卵巢的周期黄体已退化,于是同时出现卵泡发育,最终引起母畜同时发情。采用孕激素抑制母畜发情,实际上是人为地延长黄体期,起到延长发情周期、推迟发情期的作用。二是缩短黄体期,应用ＰＧＦ２α加速黄体退化,使卵巢提前摆脱体内孕激素的控制,使母畜缩短发情周期,于是在短时间内卵泡得以同时开始发育,从而达到母畜同期发情。当前较理想的同期发情药物是前列腺素及其类似物,其剂量根据药物的种类和方法而不同。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程采用子宫灌注的剂量要低于肌肉注射的剂量。在注射ＰＧＦ２α后２ｈ,配合注射ＰＭＳＧ或ＦＳＨ,可以明显提高同期发情效果。详见第７章。(３)供体母畜的超数排卵概念及原理:在母畜发情周期的适当时间,注射外源促性腺激素,使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排卵,这种方法称为超数排卵(ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ),简称超排。正常情况下,母畜卵巢上约有９９％的有腔卵泡发生闭锁而退化,只有１％能发育成熟而排卵。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程实验研究发现在母牛的黄体期结束之后,卵泡期启动之前,注射促性腺激素ＦＳＨ、ＰＭＳＧ能增强内源性ＦＳＨ的作用,能使平均１０个以上(变化范围０~１００)的卵泡不发生闭锁而正常发育,在排卵之前再注射ＬＨ或ＨＣＧ补充内源性ＬＨ的不足,可保证多数卵泡成熟、排卵。超排对于牛、羊等单胎动物效果明显,对于多胎动物意义不大。超数排卵对马很难产生反应。超数排卵理论上是越多越好,但排出的卵子数量太多,会出现受精率和收集率降低的趋势。一般认为以１０~１５个最为理想。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程超数排卵方法:主要利用缩短黄体期的前列腺素或延长黄体期的孕酮,结合促性腺激素进行家畜的超数排卵。４.供体的发情鉴定和配种超排处理结束后,要密切观察供体的发情症状。正常情况下,供体大多数在超排处理结束后１２~４８ｈ发情。以牛为例,发情鉴定主要以接受其他牛爬跨且站立不动为主要判定标准。每天早中晚至少观察３次。第一次观察到接受爬跨且站立不动的时间,视为零时,由于超排处理后排卵数较正常发情牛多且排卵时间不一致,加上精子和卵子的运行受排卵处理的影响,为了确保卵子受精,应采取增加输精次数和加大输精量的方法;新鲜精液优于冷冻精液。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程一般在发情后８~１２ｈ输第１次精,以后间隔８~１２ｈ再输精一次。５.胚胎采集利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲出,并收集在器皿中。此方法分手术法和非手术法(牛、马)两种。(１)胚胎采集前的准备①冲胚液、培养液的配制(见表９－３)。冲胚液和培养液在使用前都要加入血清白蛋白,含量一般为０.１％~３.２％,也可用犊牛血清代替,以利胚胎存活。冲胚液血清含量一般为３％(１％~５％),培养液血清含量为２０％(１０％~５０％)。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程②采集时间。不应早于排卵后的第１天,即最早要在发生第１次卵裂后(发育至４~８个细胞以上为宜),否则不宜辨别卵子是否受精(见表９－４)。一般是在配种后３~８ｄ[牛:非手术法取胚在发情配种后７ｄ;绵羊:从输卵管取胚,适宜时间为发情后２.５ｄ(５６~７６ｈ)],从子宫采胚大都在发情后６ｄ。(２)胚胎采集方法①手术法收集胚胎。羊、猪和兔等中小型动物常采用手术法收集胚胎,此法也可用于牛、马等大动物。操作时,在腹部适当部位(腹中线或肷窝)作一切口,将动物的子宫角、输卵管和卵巢部分暴露,然后注入冲胚液将早期胚胎从子宫角或输卵管冲出。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程优点:获得的胚胎数多。缺点:操作复杂,易引起母畜生殖道粘连,影响以后的繁殖力。根据冲胚部位的不同,分为以下３种方式。(ａ)输卵管冲胚法。用注射器的磨钝针头刺入子宫角尖端,注入冲卵液,然后从输卵管的伞部接取(上行法),此法适合于牛、羊、兔等;

或与此相反(下行法),伞部注入,子宫角上端接取(见图９－７(ｂ)),

猪马采用该方法。上述两种方法适合于胚胎还处于输卵管或刚进入子宫角时(排卵后４ｄ以内)。冲卵液用量１０ｍＬ。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程(ｂ)子宫角冲胚法。当确认胚胎已进入子宫角内,可采用此法。可从子宫角上端注入冲卵液,由基部接取;也可由子宫角基部注入、上端接取。这两种方式适合于各种家畜。冲卵液用量一般为３０~５０ｍＬ(以子宫角容积而定)。(ｃ)输卵管———子宫角冲胚法:结合以上两种方法,可以把输卵管和子宫角的胚胎全部冲洗出来,因此采胚率高。②非手术法。目前在牛、马等大家畜都采用此法。优点是它比手术法简便易行,对生殖道伤害小,缺点是回收率低。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程采用二路式或三路式导管冲卵器,将冲卵液通过内管注入子宫角内,然后导出冲卵液,外管前端连接一气囊,当将冲卵器插入子宫内时,充气使气囊胀大,堵住子宫颈内口,以免冲卵液经子宫颈流出(见图９－８)。每侧子宫角需用冲卵液１００~５００ｍＬ。结束后,为使供体正常发情,可向子宫内注入或肌注ＰＧＦ２α,为预防感染也可向子宫内注入抗生素。此法不能收集输卵管内的胚胎。牛、马一般在配种后６~８ｄ进行。(３)供体的术后观察精心护理,注意健康状况,留心观察是否按期发情以及生殖器官是否受到感染。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程６.胚胎的检查与鉴定胚胎检查是指在立体显微镜下,从冲胚液中寻找胚胎;胚胎鉴定则是将检查到的胚胎,应用各种方法对其质量和活力进行评定。(１)胚胎检查的方法应在２０℃~２５℃的无菌操作室内进行,常采用以下２种方法。一是静置法:静置２０~３０ｍｉｎ,弃去上液,将下面几十毫升冲胚液倒入平皿或表面皿,在立体显微镜下检查。二是用带有网格(直径小于胚胎直径)的过滤器放入冲胚液中,由上往下吸出冲胚液,最后只检查剩下几十毫升的冲胚液。检出的胚胎用吸胚器移入含有２０％犊牛血清ＰＢＳ培养液中进行鉴定。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程(２)胚胎的鉴定目前鉴定胚胎质量和活力的方法主要采用形态学方法进行,即在８０~１００倍的体视镜下,观察胚胎的形态,将胚胎进行质量分级,可分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４个等级,标准见表９－５。其中Ａ和Ｂ级胚胎可用于鲜胚移植或冷冻保存;Ｃ级只能用于鲜移;Ｄ级为不可用胚胎。不同发育阶段的牛早期胚胎以及形态异常胚胎见图９－９。胚胎的质量和活力鉴定除了形态学方法外,还有体外培养法、荧光法(活体染色法)、测定代谢活性和胚胎的细胞计数。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程７.胚胎的保存胚胎保存包括常温保存、低温保存、超低温冷冻保存以及异种活体保存等。(１)常温保存在１５℃~２５℃下,只能存活１０~２０ｈ。通常采用含２０％犊牛血清的ＰＢＳ保存液,

可保存胚胎４８ｈ。(２)低温保存在０℃~１０℃下,胚胎细胞分裂暂停,代谢减慢,能保存数天。目前低温保存广泛采用改良的杜氏磷酸缓冲液(ＰＢＳ),其优点是ｐＨ值稳定。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程保存适宜温度为:山羊、小鼠在５℃~１０℃;兔在１０℃;牛在０℃~６℃。(３)超低温冷冻保存(ａ)胚胎超低温冷冻保存具有重要意义。胚胎冷冻技术为建立优良品种胚胎库或基因库提供了条件,同时也便于胚胎的运输和移植。利用胚胎低温保存技术,可以长期保存珍贵品种或濒危物种的遗传资源,防止这些资源因疾病、自然灾害、战争等各种原因而灭绝。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程家畜胚胎库的建立,可实现以简便廉价的胚胎运输代替活畜运输,不仅节约运输和检疫费用,还可减少因运输而对活畜健康的影响和因活畜运输而传播疫病的机会。鲜胚移植时,必须实行供体和受体同地饲养、同期发情,同日回收和移植胚胎。冻胚移植则比较简单,不受时间、空间的限制,只要遇到适宜的受体,观察到受体的发情日期后,在受体处于和胚龄相应的日期时,可随时解冻移植。(ｂ)胚胎超低温冷冻保存方法。温度范围为:干冰－７９℃,液氮－１９６℃,液氦－２６９℃。按照冷冻保存程序的不同可分为常规冷冻保存和玻璃化冷冻保存两种方法。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程常规冷冻法(逐步降温法):它是将胚胎移入含低浓度抗冻剂的冷冻保存液中,通过程序冷冻控制仪使胚胎缓慢降温,以诱导胚胎外液形成冰晶,胚胎内形成玻璃化状态,而使胚胎存活的技术。到现在为止沿用的常规冷冻法,在室温下用ＰＢＳ等生理性溶液配制成１.０~２.０ｍｏｌ/Ｌ的抗冻液,将细胞置于此溶液中处理。采用的抗冻保护剂有ＤＭＳＯ、丙三醇和乙二醇等。由于细胞外部的抗冻液其渗透压比较高,为保持细胞内、外渗透压的平衡,细胞内的水分向外渗出,胚胎开始收缩。随后抗冻保护剂渗入,同时水分向细胞内回流,胚胎体积得以恢复。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程平衡时间为１０~２０ｍｉｎ。将胚胎装入配置好抗冻液的０.２５ｍＬ塑料细管中,于程序降温仪中降温。当降温至冰点或稍低于冰点温度时(含有１.５ｍｏｌ/Ｌ抗冻液,约－４℃),用浸入液氮冷却后的镊子夹住细管的棉栓部,瞬间使抗冻液产生冰晶,即人工植冰。然后以０.３~０.５℃/ｍｉｎ的速度降温至－３０℃~－３５℃,缓慢降温使得细胞内液高度浓缩,即使降温到与液氮相同的温度,胞质内也不会有冰晶生成。另外,细胞外液的冰晶之间也有部分浓缩的溶液存在,这部分溶液也不会形成冰晶。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程无论是何种溶液,在急速降温的情况下,溶液的黏性急剧增高,形成非结晶固体的现象称为玻璃样状态,即玻璃化(ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ)。溶液形成玻璃化的温度(玻璃化转相温度)在－１１０℃~－１３０℃内。若快速通过此温度域,易造成胚胎破裂。所以当样本慢速降温至－２５℃~－３５℃(或－６０℃~－７５℃)时,不直接投入液氮中,而是在液氮气中熏蒸数分钟,使其缓慢通过玻璃化转相温度,然后再投入液氮中冷冻效果较好。常规冷冻法的优点是解冻后胚胎存活率较高,适合在大规模胚胎生产中使用,但操作程序比较复杂,需要冷冻设备,冷冻过程耗时较长。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程玻璃化冷冻法:它是将胚胎放入高浓度抗冻剂的冷冻保存液中,通过快速降温使胚胎内外溶液形成玻璃化状态,从而阻止胚胎内冰晶形成时造成的物理和化学损伤。目前已研制出多种玻璃化溶液,不同的玻璃化溶液有不同的冷冻程序。这种方法的优点是操作简单,不需冷冻仪,适合胚胎的现场操作,也适合保存体外受精胚胎,缺点是每一步操作环节控制必须严格,否则冷冻效果的差异很大。１９８５年Ｒａｌｌ等人利用小鼠的胚胎为实验材料,研发了胚胎的玻璃化冷冻法(Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ)。这种方法不需要程序降温仪进行慢速降温过程。另外,由于细胞外液不生成冰晶,几乎不产生物理性的损伤,操作简单且生存率高。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程玻璃化冷冻法所采用的抗冻液,投入液氮中冷冻后细胞内、外液皆无冰晶生成,即称为玻璃化溶液。此溶液是以ＰＢＳ为基础液,添加高浓度的抗冻保护剂配制而成。当抗冻保护剂的浓度达到５０％或８.０ｍｏｌ/Ｌ以上时,选择化学毒性较低的抗冻保护剂是非常必要的。到目前为止,研制出了多种改良的玻璃化溶液,抗冻保护剂的组合也多种多样。最近,大多数研究采用乙二醇为主体抗冻保护剂(Ｋａｓａｉ,１９９７)。乙二醇具有化学毒性较低、渗透速度较快等特点。抗冻保护剂的渗透速度快和处理时间短,可避免其对细胞的化学毒性作用。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎一步法玻璃化冷冻保存:该方法利用乙二醇为主体抗冻保护剂,添加高分子聚蔗糖和渗透压较高的蔗糖,配制成约７.５ｍｏｌ/Ｌ浓度的玻璃化溶液(ＥＦＳ４０),在室温(２０℃)条件下,将胚胎直接装入含有玻璃化溶液的塑料细管中,经２ｍｉｎ平衡后投入液氮。玻璃化冷冻成功与否与处理温度、时间、玻璃化溶液、动物品种以及胚胎发育阶段有很大的关系。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎二步法玻璃化冷冻保存:分别采用乙二醇或丙三醇以及乙二醇和ＤＭＳＯ为主体抗冻保护剂,配制成ＥＦＳ、ＧＦＳ、ＥＤＴ玻璃化溶液,在室温(２０℃~２５℃)条件下,先将胚胎在１０％乙二醇(或丙三醇或１０％乙二醇＋１０％ＤＭＳＯ)溶液中预处理５ｍｉｎ,然后再移入含有上述玻璃化溶液的细管中,平衡３０ｓ后将细管封口,投入液氮中冷冻保存。小鼠、家兔、牛和羊体内生产的囊胚经冷冻解冻后的继续发育率达９２％~９８％。二步法冷冻处理的好处在于,既能使抗冻保护剂向细胞内部充分渗透、又能避免高浓度玻璃化溶液的化学毒性的损伤,同时又能很好地形成玻璃化状态,提高囊胚冷冻－解冻后的胚胎存活率。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程８.解冻方法解冻操作直接影响胚胎解冻后的成活率,在此过程中要严格控制环境温度、解冻液中抗冻剂的浓度与胚胎的脱毒时间,防止胚胎受到化学毒性和渗透压应激导致的损害。常规冷冻法和玻璃化冷冻法的解冻方法有所不同。(１)常规冷冻法的解冻方法常规冷冻法保存的细管,胚胎由液氮中取出,在空气中停留１０~１５ｓ,而后浸入室温水或３７℃水浴中解冻。空气中停留是为了慢速通过胚胎易产生破裂的温度域(即－１１０℃~－１３０℃)。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程快速降温时不论是－２５℃~－３５℃或－６０℃以下冷冻保存的样本,其细胞内液的浓缩程度均不充分,在解冻升温过程中有冰晶形成现象,这种现象称为脱玻璃化(Ｄｅｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ)。脱玻璃化的产生对细胞具有致命性的打击。产生脱玻璃化的温度域为－８０℃~－５０℃,升温速度越慢越容易产生这种现象。为避免脱玻璃化现象的产生,解冻时必须快速通过这个温度区域。所以细管在空气中停留后,应迅速浸入水浴中升温。解冻后用ＰＢＳ或其他等渗液稀释的０.５ｍｏｌ/Ｌ蔗糖液脱出细胞内部的抗冻保护剂,然后将胚胎移入等渗生理溶液中洗净备用。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程(２)玻璃化冷冻法的解冻方法玻璃化冷冻保存的样本,解冻时和慢速冷冻法基本相同,细管在空气中停留１０~１５ｓ后浸入室温(２０℃~２５℃)水浴中解冻。玻璃化冷冻法由于抗冻液的摩尔浓度较高,降温和升温过程中,玻璃化转相温度通过得比较缓和,可彻底防止胚胎的破裂现象。由于玻璃化液中抗冻剂的浓度较高,胚胎解冻后首先要脱出抗冻剂,通常胚胎解冻后要在０.３~１.０ｍｏｌ/Ｌ蔗糖溶液中稀释以脱出细胞内部的抗冻剂。然后再于等渗生理溶液(ＰＢＳ液等)中洗净,进行胚胎鉴定后供移植或其他实验使用。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程９.胚胎移植技术胚胎移植和胚胎采集一样,也分为手术法和非手术法。(１)手术法一般在排卵侧的肷部作切口,若做两侧移植,则在腹部中线。牛、羊３日龄以前的胚胎(８细胞以前),应将吸有胚胎的细管由输卵管伞插入,直接注入壶腹部;５日龄后的胚胎,应移植在距宫管结合部５ｃｍ处的子宫角顶端。为了防止胚胎粘到细管内,吸入胚胎的程序如图９－１０所示。(２)非手术法上一页下一页返回９.２胚胎生物工程该法只适合大家畜。先直肠检查确定黄体位于哪一侧和发育情况,而后握住子宫颈,将移植管(注射器连接导管或特制金属移植器)插入与黄体同侧的子宫角内,注入胚胎。移植时动作要迅速准确,避免对组织造成损害。黄体发育不良的母畜最好不作受体。９.２.２性别控制技术动物性别控制(ＳｅｘＣｏｎｔｒｏｌ)是指通过人为的干预或操作,使母畜按人们的愿望繁殖所需性别后代的技术。其意义在于通过控制后代性别比例,可以充分发挥限性性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度和肉质等)的生产性能,增加经济效益;增加选择强度,加快育种进程。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程早在１９０２年,ＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａＢ.Ｃ.等在研究蝗虫精细胞时,首先提出了性别决定的染色体理论。２０世纪５０年代末,人们证明了鼠和人的雄性性别是由Ｙ染色体决定的。１９９０年,英国学者Ｓｉｎｃｌａｉｒ等发现哺乳动物(包括人类)Ｙ染色体短臂上靠近长臂染色体区的３５ｋｂ区域存在性别决定区(ＳＲＹ,睾丸决定因子基因)。１９９１年,Ｋｏｏｐｍａｎ等进行了小鼠性反转试验,证明了ＳＲＹ为哺乳动物的性别决定基因。哺乳动物性别控制的原理:性染色体Ｘ和Ｙ,ＸＸ为雌性,ＸＹ为雄性,卵子只产生一种性染色体,即Ｘ,而精子为两种,即Ｘ和Ｙ。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程正常情况下,精液中Ｘ和Ｙ两者之比为１∶１,即后代中雌雄个体的比例也为１∶１。目前,对哺乳动物进行性别控制的方法有３种,一是Ｘ、Ｙ精子的分离。二是早期对胚胎进行性别鉴定。三是控制受精的环境。１.Ｘ、Ｙ精子的分离已经知道,哺乳动物中,Ｘ精子的ＤＮＡ含量比Ｙ精子高出３％~４％,根据这一差异,利用流式细胞仪可以对Ｘ、Ｙ精子进行分离,用分离后的精子进行人工授精或体外授精,从而可以实现对后代的性别进行控制。１９８９年Ｊｏｈｎｓｏｎ等人首先报道用流式细胞分离仪成功分离兔子活的Ｘ和Ｙ精子,用分离的精子授精并产下后代。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程接着在家畜牛(Ｃｒａｎ等,１９９３,Ｓｅｉｄｅｌ等,１９９７)、猪(Ｊｏｈｎｓｏｎ,１９９１;Ｒａｔｈ等,１９９７)羊(Ｃｒａｎ等,１９９７)试验中都相继取得成功。近年来人们在Ｘ、Ｙ精子分离技术上取得了长足进展,尤其是在奶牛方面,目前国外已将分离后的精液商品化,我国广西大学、内蒙古赛科星生物技术公司、ＸＹ种畜(天津)有限公司、大庆田丰生物工程公司等已先后引进了流式细胞检索仪,部分公司取得了较好的效果。２.早期胚胎性别鉴定运用细胞学、分子生物学或免疫学方法可对哺乳动物附植前的胚胎进行性别鉴定,通过移植已知性别的胚胎,可控制后代的性别比例。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程①核型分析法(细胞学):通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别,ＸＸ为雌性,ＸＹ为雄性。这种方法准确率可达１００％,但取样时对胚胎损伤大,难以在生产中推广应用。②ＳＲＹ片段的ＰＣＲ扩增法(分子生物学):其理论基础是Ｙ染色体上有一段性别决定区(ＳＲＹ)。原理为:先从胚胎中取出部分卵裂球,提取ＤＮＡ,然后用ＳＲＹ基因的一段碱基作引物,以胚胎细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,对扩增产物进行电泳,通过检测ＳＲＹ基因条带的有无来判断是雄性或雌性。③免疫学方法:利用雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(Ｈ－Ｙ抗原)这一理论,对胚胎进行性别鉴定。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程３.控制受精的环境有研究表明,Ｙ精子嗜碱而不耐酸,Ｘ精子嗜酸而不耐碱,当ｐＨ值低于６.８时,Ｙ精子活力减弱,运动缓慢,就会降低与卵子结合的机会,从而达到一定性别控制的目的。９.２.３体外受精技术１.概述体外受精技术(InVitroFertilization,ＩＶＦ)是指通过人为操作使精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术。在生物学中,把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程在医学中,把体外受精胚胎移植到母体后获得的婴儿称为试管婴儿。雌性动物卵巢中,有数万或数十万个卵母细胞资源,但就母畜一生而言,９９.９％以上的原始卵泡都注定要闭锁,只有极少数能够发育成熟并排卵。自然情况下雌性动物的遗传资源并未得到充分利用。卵泡或卵母细胞体外培养技术,是挖掘这些潜在的卵母细胞资源的有效手段,可为胚胎工程提供大量的卵子。这样不仅能够进一步发挥优良母畜的繁殖潜力,还可以充分利用老年或淘汰良种母畜体内的卵母细胞资源。体外受精作为一种新的繁殖技术,能够提供大量的胚胎来源,可以满足胚胎工程研究以及生产性胚胎移植的需要。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程体外受精技术的进一步发展和完善,为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能;对充分发挥良种母畜的繁殖潜力,加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。对哺乳类动物体外受精的研究已经有１１０多年的历史。１９５９年世界上最早在家兔上通过体外受精获得了试管动物,２０世纪６０年代以后,ＩＶＦ的研究迅速发展,特别是对精子获能技术和细胞培养方法的许多重要改进,使ＩＶＦ由对实验动物的研究跨入了对家畜的研究领域。将ＩＶＦ的胚胎移植给受体动物,已在山羊、绵羊等多种动物获得了试管后代。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程２.体外受精技术的基本程序(１)卵母细胞的采集和成熟培养卵母细胞的采集:采集的方法有以下３种。①超数排卵,通过超数排卵后从输卵管中冲出的成熟卵子,直接与获能精子受精,这种采卵方式多用于鼠和家兔等实验动物,也可用于猪、羊等小型多胎家畜,在大家畜中,由于操作程序复杂,成本较高,很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子排出后维持受精能力的时间,一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。②从活体卵巢中采集,借助超声波探测仪或腹脏镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程③从母体屠宰后离体卵巢上采集,从刚屠宰的母畜体内摘出卵巢,经洗涤、保温后,快速运到实验室,在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面的卵母细胞。这种方法的最大优点是材料来源丰富,成本低廉。(２)卵母细胞的选择按卵母细胞上卵丘细胞的厚度和细胞质的均匀度将其分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４个等级,体外受精实践中一般选择Ａ、Ｂ级的卵母细胞。(３)卵母细胞的成熟培养上一页下一页返回９.２胚胎生物工程由超数排卵或从排卵前卵泡中采集的卵母细胞已在体内发育成熟,不需培养,可直接与精子受精。对未成熟的卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时,先将采集的卵母细胞在实体显微镜下挑选和洗涤后,再放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用ＴＣＭ１９９添加犊牛血清、促性腺激素、雌激素和抗菌素等成分。通常采用微滴培养法,微滴体积为５０~２００μＬ,每滴中放入的卵母细胞数按每５μＬ一枚计算。之后将其放入二氧化碳培养箱中培养,培养条件为３８℃~３９℃、湿度１００％和５％ＣＯ２的空气。牛、绵羊和山羊培养２０~２４ｈ,猪为４０~４４ｈ。经染色后,在显微镜下观察,可见卵母细胞的发育情况。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程哺乳动物体外受精示意图如图９－１１所示。３.体外受精(１)精子的获能处理哺乳动物的获能方法有培养和化学诱导两种方法。啮齿动物、家兔和猪精子的精子通常采用培养获能法,从附睾中采集的精子,只需放入一定介质中培养即可获能。但是射出的精子则需要用溶液洗涤后再培养获能,这是因为射出的精液中含有去能因子,通过洗涤可以消除去能因子。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能。一般为肝素和钙离载体。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程(２)受精即获能精子与成熟卵子的共培养,精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关,一般为８~２４ｈ。(３)胚胎的培养精子和卵子受精后,受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力。提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系,在家畜中,胚胎培养液分为复杂培养液和化学成分明确培养液两大类。传统的培养方法中多采用复杂的培养液,而近年来成分明确培养液的研究引起了广泛重视,并取得了很大进展。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程当胚胎发育到一定阶段时,在立体显微镜下观察,质量较好的胚胎可移植到受体母畜生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存,质量差的应舍弃。９.２.４克隆技术所谓克隆就是英语“ｃｌｏｎｅ”的译音,在动物繁殖学中意为无性繁殖,即不需配子参与即实现动物个体数量的增多。就像按模具复制东西,所以克隆动物又称复制动物。哺乳动物的克隆技术在广义上是包括胚胎分割和细胞核移植技术,狭义上它仅指细胞核移植技术,其中包括胚胎细胞核移植技术和体细胞核移植技术。１.胚胎分割上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎分割就是用显微手术的方法将附植前的一枚胚胎分割为二,甚至四或八,然后分别将其移植给受体,以获得同卵双生或同卵多生后代。这是动物克隆技术的一种,也是胚胎工程的一种基本技术。(１)发展概况哺乳动物胚胎分割技术开始于Ｎｉｃｈｏｌａｓ对大鼠２－细胞卵裂球的分离和培养,Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ等研究了小鼠１/４,１/２,３/４卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。２０世纪７０年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程通过胚胎分割,目前已在山羊和绵羊上获得同胚二分割胚后代,绵羊的同胚三羔、同胚四羔。在国内也获得了山羊、绵羊同胚双生后代。窦忠英等以黄牛作受体,奶牛胚胎二分割移植妊娠率为５０％;樊敬庄等用简易徒手分割法获得同胚双犊,１９９０年奶牛胚胎二分割移植妊娠率为４６％,得到国内首例胚胎四分割同胚三犊,四分胚移植妊娠率为５０％。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎分割技术经过近２０年的发展,在理论和技术方法上都已完善,尤其是在牛羊的胚胎分割技术、增加胚胎移植中的有效胚胎数、提高妊娠率、增加克隆后代的数目等方面,与细胞核移植技术相比,有更高的成功率。目前在一般情况下,牛、羊细胞核移植产生后代的成功率在１０％以下,而胚胎分割的半胚产仔率一般接近５０％。胚胎分割技术可以与其他胚胎生物技术相结合,为胚胎转基因技术、性别鉴定技术提供活胚检查的方法,为胚胎嵌合、胚胎干细胞技术提供卵裂球分离的方法和手段。胚胎分割还可以获得遗传上同质的后代,为家畜育种研究提供有价值的材料。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程在胚胎数一定的情况下,通过胚胎分割可以获得较多的后代,有助于提高家畜的繁殖力。由此可见,进一步提高胚胎分割技术的生产效率、完善技术和培养系统,可以使这门技术更好地发挥作用,为畜牧业生产服务。(２)胚胎分割的基本程序分割器具的准备:胚胎分割器械有体视显微镜、倒置显微镜、显微操作仪、胚胎固定管和分割针。胚胎预处理:为了减少胚胎分割的损伤,在分割前一般用链霉蛋白酶进行短时间的处理,使透明带软化变薄或去除。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎分割:先将发育好的胚胎移入含有操作液滴的培养皿中,然后在显微镜下用分割针或分割刀将胚胎一分为二或四甚至八。分割胚的培养:为提高分割胚胎移植的妊娠率和胚胎利用率,分割后的胚胎需放入空透明带中或用琼脂包埋移入中间受体在体内培养或直接在体外培养。分割胚胎的保存和移植:胚胎分割后可直接移植给受体,也可进行超低温冷冻保存。哺乳动物胚胎分割示意如图９－１２所示。２.胚胎细胞核移植技术上一页下一页返回９.２胚胎生物工程胚胎细胞核移植技术又称胚胎克隆,即通过显微操作将供体胚胎解离成单个卵裂球后注入去核的成熟卵母细胞内融合,产生大量遗传同质克隆胚胎的技术。胚胎细胞核移植最早是由Ｂｒｉｎｇｓ等于１９５２年在两栖类动物蛙上完成的。此后人们对鱼类和两栖类动物进行了深入研究。哺乳动物核移植在２０世纪７０年代以后才有了较大的发展。人们相继在小鼠、绵羊、山羊、牛、兔、猪等动物上获得成功。唐铁山１９９４年得到胚胎细胞核移植兔７只,窦忠英１９９５年得到国内首例胚胎细胞核移植猪６头。上一页下一页返回９.２胚胎生物工程３.胚胎克隆的操作程序哺