CN115820728B 一种基因编辑的方法和用途 （上海贝斯昂科生物科技有限公司）

A,2021.04.16A,2019.05.03A,2017.09.15A,2020.05.19A,2022.08.02WO2024012300A1,2024.01.18编辑系统对目的多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A子或点突变起始密码子；所述碱基编辑系统包述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨酶片段；(b)合蛋白或其变体靶向至所述靶C碱基和/或靶A碱2基编辑系统对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基，以在VPF基因编码区引入终和/或，所述腺嘌呤脱氨酶选自野生型tadA、突变型tadA，或者两者组成的复合物wtTadA–TadA。2)所述腺嘌呤融合蛋白的结构为NH2_[核定位信号]_[第一nCas片段]_[链接肽]_[腺3)所述胞嘧啶颠换融合蛋白自N端至C端依次包括第2)所述腺嘌呤融合蛋白的氨基酸序列如S3)所述胞嘧啶颠换融合蛋白的氨基酸序列如3码引导核苷酸的多核苷酸的表达载体递送至待15.权利要求1中所述的碱基编辑系统在制备治疗VPF过表达相关疾病产品中的用途，4[0003]老年性黄斑变性(Age_relatedmaculardegeneration，AMD)是导致老年群体不(dry)和湿性(wet)两种类型。湿性AMD临床进展表现为脉络膜血管新生(choroidal内皮细胞生长因子(VPF)在CNV过程中起到重要作用，Nozaki等通过对AMD病人的视网膜和[0004]CRISPR/Cas9基因编辑技术基于Cas9蛋白对DNA双链进行切割，断裂的DNA双链在[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种编辑VPF基因的方法5包括利用碱基编辑系统对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基，以在VPF基因编[0007](a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨[0008](b)引导核苷酸或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述术引起的DNA双链所造成的有害影响。本发明所优选使用的将脱氨酶嵌合到Cas9蛋白中间[0017]图5显示为利用腺嘌呤碱基编辑器突变起始密码子(16位点)在RPE细胞系中的效[0019]图7显示为利用腺嘌呤碱基编辑器突变起始密码子(16位点)在Muller细胞系中的[0023](a)融合蛋白或其变体或其编码多核苷酸，所述融合蛋白中包括Cas9片段和脱氨6[0024](b)引导核苷酸或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述[0028]对VPF多核苷酸上的靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基会导致VPF多核苷酸中C转化至由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；所述终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；所述终止密码子经由所述编码链上的第一从TGG至TGA转化生成；所述终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TAC至TAG[0030]所述起始密码子为ATG或CTG。所述起始密码子突变经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；所述起始密码子突变经由所述互补链上的第二个A的脱氨多个基因以表达融合蛋白或其变体的脱氧核糖核酸(DNA)序列。[0035]所述胞嘧啶脱氨酶选自以下中的一个或多个：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、7[0038]在本发明的某些实施方式中，所述胞嘧啶融合蛋白的结构为NH2_[核定位信号]_[第一nCas9片段]_[链接肽]_[胞嘧啶脱氨酶片段]_[链接肽]_[第二nCas9片段]_[GS肽[0039]在本发明的某些实施方式中，所述腺嘌呤融合蛋白的结构为NH2_[核定位信号]_基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序[0042]在本发明的某些实施方式中，所述引导核苷酸的靶向序列为SEQIDNo.21_SEQ8[0048]本发明所述方法适用的基因编辑的对象没有特别的限制，可以在体外或体内实定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的[0056]所述VPF过表达相关疾病例如为癌症或眼科疾病。所述癌症例如为肺癌、甲状腺[0057]本发明还提供一种预防或治疗VPF过表达相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述方法中的碱基编辑系统[0058]所述VPF过表达相关疾病例如为癌症或眼科疾病。所述癌症例如为肺癌、甲状腺9[0065]利用碱基编辑敲除基因的sgRNA设计需要考虑多个因素：一是可形成终止密码子辑系统的窗口内；三是核酸酶识别的问区序列邻近基序(ProtospacerAdjacentMotif，PAM)不同。表1罗列出了可以诱导成终止密码子或/和突变起始密码子所在序列，后续的sgRNA设计均是参考这42条序列获得。此处仅展示靶向为PAM序列为NGG的核酸酶(图1所可诱导终止密码子以及起始密码子所在序列位置(5/_3/)Tcgcactgaaacttttcgtccaacttctgggctgttctcgctt*产生终止密码子ttatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagat产生终止密码子caaagaaagatagagcaagacaagaaaagtaagtggccctgac产生终止密码子ttcgaggaaagggaaaggggcaaaaacgaaagcgcaagaaatc产生终止密码子ggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatg产生终止密码子cagtcgcgctgacggacagacagacagacaccgcccccagccc产生终止密码子acgcggcggcgagccgcgggcaggggccggagcccgcgcccgg产生终止密码子gctcgggccgggaggagccgcagccggaggagggggaggagga产生终止密码子aggaagaggagagggggccgcagtggcgactcggcgctcggaa产生终止密码子ctccagccgcgcgcgctccccaggccctggcccgggcctcggg产生终止密码子ctttctgtcctcagtggtcccaggctgcacccatggcagaagg产生终止密码子ccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaaggtgagtc产生终止密码子tgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaat产生终止密码子agaccctggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcga产生终止密码子aggagtccaacatcaccatgcaggtgggcatctttgggaagtg产生终止密码子ggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagctt产生终止密码子taggagagatgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcag产生终止密码子atttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaa产生终止密码子actcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtac产生终止密码子aggagagggggccgcagtggcgactcggcgctcggaagccggg产生终止密码子ggggaggaagagtagctcgccgaggcgccgaggagagcgggcc产生终止密码子catcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgctgcaatga产生终止密码子gacaagaaaaaaaatcagttcgaggaaagggaaaggggcaaaa产生终止密码子gaaagggaaaggggcaaaaacgaaagcgcaagaaatcccggta产生终止密码子aagaggagagggggccgcagtggcgactcggcgctcggaagcc产生终止密码子gcgctcggaagccgggctcatggacgggtgaggcggcggtgtg产生终止密码子ccatgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgcctt产生终止密码子ttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctcta产生终止密码子tgctctctttctgtcctcagtggtcccaggctgcacccatggc产生终止密码子agaaatcccggtataagtcctggagcgtgtacgttggtgcccg产生终止密码子cccgctgctgtctaatgccctggagcctccctggcccccagta产生终止密码子tcggcgctcggaagccgggctcatggacgggtgaggcggcggt产生终止密码子tttttttattttccagaaaatcagttcgaggaaagggaaaggg产生终止密码子gcagtccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtt产生终止密码子acaccgcccccagccccagctaccacctcctccccggccggcg产生终止密码子ggagccttgccttgctgctctacctccaccatgccaaggtaag产生终止密码子tggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccct产生终止密码子tggtggacatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacat产生终止密码子agtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgt产生终止密码子Ggtataagtcctggagcgtgtacgttggtgcccgctgctgtct产生终止密码子Cccgcagctgaccagtcgcgctgacggacagacagacagacac破坏起始密码子ccggtcgggcctccgaaaccatgaactttctgctgtcttgggt破坏起始密码子℃_85℃at_2℃/s；85℃_25℃at_0.1℃/s；holdat4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：[0073]商业化的RPE细胞(ARPE_19)与Muller细胞(MIO_M1)接种培养于添加10％FBS的无抗生素的培养基。转染以脂质体转染为例，按照LipofectamineTM2000Transfection白质粒或CGBE融合蛋白质粒)与1μgpGL3_U6_sgRNA_GFP质粒混匀，共转染至每孔细胞中，CE_A3A_BE4max(氨基酸序列如SEQIDNo.18所示)，CGBE融合蛋白质粒CE_CGBE_A3A(氨基[0076]通过对测序数据分析，发现在RPE细胞系中针对13个可以诱导成终止密码子的位℃_85℃at_2℃/s；85℃_25℃at_0.1℃/s；holdat4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：[0083]商业化的RPE细胞(ARPE_19)与Muller细胞(MIO_M1)接种培养于添加10％FBS的无抗生素的培养基，转染以脂质体转染为例。按照LipofectamineTM2000Transfection白质粒、腺嘌呤融合蛋白质粒或CGBE融合蛋白质粒)与1μgpGL3_U6_sgRNA_GFP质粒混匀，器选择各选择一个常规设计的和可以显著降低脱靶的，常规设计的三个分别为：A3A_BE4max(addgene：#157943)，ABEmax(addgene：#164415)，VPF_14和VPF_15均能有效编辑，其中VPF_14位点的编辑效率高到96孔板中，等两周以后，取部分细胞通过裂解鉴定基因型，裂解液的成分为50mMKCl，1.5mMMgCl2，10mMTrispH8.0，0.5％NonidetP_40，0.5％Tween20，100μg/ml毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板[0093]通过对数据分析，不同类型的碱基编辑细胞系均能实现VPF蛋白的敲除(图8所[0095]对于实施例3获得的细胞系，利用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒CGBE_A3A)所产生的SNP与野生型接近，远