蛋白质工程试题

蛋白质工程试题

1.蛋白质分子的构型与构象

构型：是分子中原子的特定空间排布。当构型相互转变时，必需

有共价键的断裂和重形成。根本构型有L-型和D型两种。这种构型无

法通过单键的旋转相互转换。

构象:是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，

构象的转换不要求有共吩键的断裂和重形成，在化学上难以区分和分别。

2.内核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保

守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级构造单元组成。

内核假设原理就是全部蛋白质的折叠形式主要打算于其内核中残基的

相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法制

造出超越自然蛋白质所具有二级构造的蛋白质二级构造。

3.van"tHoff焰平衡常数与焰/燧的关系式为：-RTInK=出-

RS。取对数可以变为：InK二-AH/RT+dS/R。进一步推导可以变

为：d(InK)/d[1/T]=-AH/RO基于止匕,以InK对1/T可以得到

一条曲线。在这条曲线上任何一点的斜率就是aH/R,其中的称为

van"tHoff焰。通过解析van"tHoff焰随温度变化的曲线特点,可

以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。

也就是通过这样的曲线分析，可以推测蛋白质自然构象退在折叠时的

容易程度。

4.盒式突变法也称为片断取代法〔DNAfragment

replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限

制性酶切位点,用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取

代目标基因上的一段DNA序列。

5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的

为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体melton

globuleo熔球体具有自然态的大多数二级构造，但不如自然构造致密,

蛋白质内部的密积存相互作用尚未形成，环肽区和外表构造多数处于

未折叠状态，侧链可以活动。非折叠态卷折成熔球体包含了蛋白质折

叠的主要奇特一疏水侧链的包埋。

6.反向折叠设计在蛋白质工程中，全蛋白质设计是以弥补自然蛋

白质构造和功能在应用方面的缺乏为目的，依据人类所期望的构造和

功能，实行工程手段，来人工设计的氨基酸序列，这样的设计研究称

为反向折叠争论。在全蛋白质设计的反向折叠争论中，需要采取的根

本策略是通过设计的氨基酸序列，来加强或者减弱蛋白质的某些相互作

用力，使设计的序列能最终具有所期望的构造和功能。

7.功能基团的特异性修饰

蛋白质中，不仅末端氨基酸具有氨基和艘基，很多链中氨基酸侧

链也具有羟基、筑基、氨基和竣基等能进展特征性化学反响的功能基

团。利用这些功能基团的化学反响性可以进展蛋白质功能基团的特异

性修饰。

8.基因突变技术

在基因水平上设计并使某特定基因发生变异，对该基因所编码的

蛋白质进展改造，在突变基因表达后、用来争论雷白质构造功能的一

种方法。

9.融合蛋白质

重组DNA技术允许在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，

并且通过基因融合产生的蛋白质叫做融合蛋白质。

1.蛋白质工程就是以蛋白质的精细构造和生物功能间的相互关系

为根底，主要以基因工程为手段，依据人类自身的需要，定向地改造

自然蛋白质，甚至于制造自然界本不存在的、具有优良特性的的蛋白

质分子。

2.在蛋白质分子中，特别在球蛋白分子中常常可以看到由假设干

相邻的二级构造元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、

有规章的二级构造组合〔Combination),称为超二级构造或者称为

构造模体、或者标准折叠单位。

3.全蛋白质的设计过程，与正向折叠争论过程相反。它是以弥补

自然蛋白质的构造和功能在应用方面的缺乏为目的，依据人类所希

望的构造和功能，实行工程手段，来人工设计的氨基酸序列，这样的

设计争论称为反向折叠争论。

4.基因重组表达技术的应用是实施蛋白质工程的主要途径。然而，

利用基因重组表达技术产生的突变基因在生物体内有时无法有效表达，

从而影响目标蛋白质产品的有效获得。利用化学方法直接转变蛋白质

分子，可以弥补分子生物学途径中蛋白质表达体系的缺乏,而且往往

可以获得具有颖功能的蛋白质或肽链产品。

5.蛋白质工程争论的根本途径是：从预期功能动身，设计期望构

造，寻求与之相对应的氨基酸序列；再转译成核昔酸序列，形成人工

基因；最终承受基因工程技术，通过生物合成产生蛋白质。

6.通过蛋白质的热力学争论方法可以为鉴别蛋白质分子的自然态

和退折叠态供给信息。可以重折叠的退折叠态被认为是多肽链在热力

学平衡条件下构象不停地变化的状态。平衡可以向自然态移动，也可

以向退折叠方向移动，移动的方向取决于环境条件的变化。虽然，热

力学方法能供给蛋白质多肽链构象状态的信息，但是，无法分析状态

变化过程的时间效应。为此，需要开展折叠过程的动理学争论。

7.在生体细胞内蛋白质一级构造中的疏水基团趋向于埋藏在蛋白

质分子内部，亲水基团则倾向于暴露在分子外表。

8.在蛋白质设计开头之前，要对所要改造的自然蛋白质进展表征，

内容包括：构造检索〔依据ProteinDataBank）分析、功能鉴定和活

性筛选，以确定其氨基酸序列、三维构造、稳定性、催化活性等

9.设计一个颖蛋白质构造的中心问题是设计一个具有稳定的、独

特的三维构造序列。而稳定的、独特的三维构造的形成意味着氨基酸

序列由线性聚合链的相对无序状态转换为高度的有序状态。在这样一

个与自发的能量转换相反的过程中，需要抑制的根本障碍是线性聚合

链的构象熔。

10.蛋白质的修饰和表达处于蛋白质工程的实施阶段核心位置。修

饰包括直接对蛋白质分子的化学修饰和基于基因突变技术的分子生物

学修饰；而表达则是关系蛋白质产品获得成效的关键环节。

11.蛋白质工程中实施的基因突变主要有4种类型：基因的专一性

位点突变、基因的区域性定向突变、基因融合和基因剪接、tRNA介

导定点参入非自然氨基酸。

12.蛋白质的热力学与动理学的争论说明：具有生物活性的蛋白质

自然态是在热力学平衡状态下的单一构象状态，而失活态则是多构象

状态。

13.一般而言，在生体细胞内蛋白质一级构造中的疏水基团趋向于

埋藏在蛋白质分子内部，亲水基团暴露在分子外表。在形成这样的疏

水核心的同时，必定有一局部亲水性主链被埋在里边。为了解决这样

的能量不稳定的冲突，处于分子内部的主链极性基团需要被一种作用

力一氢键中和，才能到达能量的平衡。在这种能量平衡中，蛋白质主

链会产生折叠而产生由氢键维系的有规章的构象，称为二级构造。

1.蛋白质工程与基因工程、酶工程的关系

蛋白质工程与基因工程、酶工程关系亲热，但也有着本质的不同。

基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内,并在其中

进展表达，它的产品还是该基因编码的自然存在的蛋白质。酶工程是

将生物界已存在的酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应

用于生产生活等各方面的一门科学技术〔如：利用a-淀粉酶、葡萄糖

淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，生产出高果糖浆；

利用加酶洗衣粉降解衣物有机质等〕。而蛋白质工程则是进一步依据

分子设计的方案，通过对自然蛋白质的基因进展改造，来实现对其所

编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是自然的蛋白质，而是经过改

造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。

2.在蛋白质溶液体系中，影响蛋白质构象形成的作用力

蛋白质分子的多肽链是具有氨基酸侧链的线性分子。蛋白质多肽

链的构象除了取决于共价键〔在合成中形成的共价键、合成后局部蛋

白质二硫键的形成或断裂以及合成后的加工〕外，在细胞溶液中，合

成后还要经过氨基酸残基间和不同肽段间的非共价键相互作用,形成

肯定的构象角组合，在此根底上形成特定的构象，也就是具备了特定

的三维构造。

3.基因的区域性定向突变

基因工程技术不仅可以产生位点特异性突变，也可以产生区域性

的突变。常用的方法有龛式突变法〔Cassettemutagenesis),也称

为片断取代法〔这一方法的要点是

DNAfragmentreplacement)0

利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任

何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。这

样，不仅可以通过转变几个氨基酸序列来争论蛋白质的构造和功能之

间的关系，也可以通过盒式突变产生嵌合蛋白质。

1.蛋白质分子设计的必要性、目的和途径

〔1〕必要性：由于有着巨大分子量的蛋白质分子含有大量的氨基

酸，以随即方式转变自然蛋白质的氨基酸序列、制造具有型氨基酸序

列的蛋白质工程，无法有效地获得具有型三维构造和功能的蛋白质分

子。为了解决这一难题，实施蛋白质工程时，需要以蛋白质的结

构和功能争论为根底，首先有目的地有效开展蛋白质的分子设计。〔2〕

目的：1.为蛋白质工程供给指导性信息；2.探究蛋白质的折叠机理。

(3)途径：1.基于臼然蛋白质构造的分子设计；2.仝蛋白质设计。

3.在蛋白质的修饰改造中Kunkel突变法的原理

这种方法是由Kunkel在1985年制造的。先将突变的基因克隆在

M13噬菌体载体上，然后转染大肠杆菌。作为受体的大肠杆菌是一种

dut—ung一突变的菌株。dut—突变导致大肠杆菌中dUTPase有缺陷，

因此细胞中的dUTP无法转变为dUMP而大量积存，最终导致一局部尿

喘D定参入到正常复制的DNA上，使尿嚓嚏代替正常状况下的T。ung—

突变导致大肠杆菌中尿喀口定-N-糖基化酶有缺陷，因而不能除去DNA结

合的尿嚓口定。在大肠杆菌dut—ung—F1菌株中，生长中的M13噬菌

体最终产生的含外源基因的DNA(+)链上含有20—30个尿口密碇。以这

种DNA(+)链做模板，与含有突变的寡核苗酸引物混合，

同源序列将退火。在DNA聚合酶、4dNTP存在的状况下,引物延长，

合成一条互补链。该链含有突变区段，但不再含尿口密陡，接着在DNA

连接酶的作用下，封闭缺口而连接。当这种M13双链分子转染野生型大肠

杆菌后QNA上的尿啮咤很快被除去,导致模板链在复制前就被除去，而

含有突变基因的无尿口密症链则能正常复制。最终获得的噬菌体，大

局部由这种无尿嚓D定的突变基因链形成，从而很好地抑制了野生型

M13噬菌体的形成。约50%以上的噬菌体斑含有突变基因，大大提高

了突变体产生的效率。

4.蛋白质的热力学性质分析中热容量试验的内容

近30年来进展起来的微分扫描量热仪试验，使得在蛋白质的折叠

或者退折叠过程中，通过直接测定热容量的变化，可以测定得到婚变

化和嫡变化。测定热容量时，微分扫描量热仪以恒定的速率加热放在

量热池中的窜白质溶液和作为参照的缓冲液量热池。使两个量热池维

持一样的温度时，两个量热池在热量需求上的差异，就是两池中液体

热容量的差异。由于缓冲液量热池的热容量是的，所以可以据此求得

蛋白质量热池的热容量。热容量反响了热过程中的能量信息，也就是

焰和嫡作为热力学量与冰系对热量

dT。热量的增加一方面使体系的内能增加，的吸取有关。在压力

恒定的条件下，dH二c

P

另一方面通过使体系的体积转变也会对环境做功，所以与吸热直

接相关的是烙而不是内能。体系热容量的大小与体系的微观组分排布

方式所吸取的热量有关，所以热容量也与

dT/To熠有关。这样,在定压的条件下，热容量和燃的关系可以

描述为：dS=dH/T=c

P

由此可见，通过热容量试验，测定得到给变伤口端变化，可以推

测蛋白质体系构象的稳定性。

2.蛋白质设计中需要遵循的根本原理

〔1〕内核假设：所谓内核是指蛋白质在大在然的进化中形成的保

守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级构造单元组成。

内核假设原理就是全部蛋白质的折叠形式主要打算于其内核中残基的

相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创

造出超越自然雷白质所具有二级构造的蛋白质二级构造；〔2〕雷白质

内部构造的密积存和无重叠特征；〔3〕蛋白质内部氢键的形成要最

大限度地弥补溶剂键断裂所带来的能量损失；〔4〕疏水和亲水基团要

合理地分布在溶剂不行及外表和可及外表；〔5〕在金属蛋白质中，配

位残基的替换要满足金属几何配位原则；同时，围绕金属中心要有第

二壳层的存在；〔6)最优的氨基酸侧链几何排布；［7］构造和功能

的专一性。

四、论述题

2.利用基因工程技术定向改造蛋白质的主要类型与内容

(1)基因的专一性位点突变：专一性位点突变都是在含有突变序

列的寡核苜酸引物的介导下进展的，因此称为寡核甘酸介导的位点特

异性突变。在这类突变中PCR技术的应用格外普遍。主要有：Kunkel

突变法、PCR的突变法、基于抗生素抗性恢复的突变法、基于去除特

定限制酶切位点的突变法等。

(2)基因的区域性定向突变：基因工程技术不仅可以产生位点特

异性突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法有盒式突变法

〔Cassette,mutagenesis〕，也称为片断取代法〔DNAfragment

］这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限

replacemento

制性酶切位点,用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取

代目标基因上的一段DNA序列。这样，不仅可以通过转变几个氨基酸

序列来争论蛋白质的构造和功能之间的关系，也可通过盒式突变产生

嵌合蛋白质。

(3)基因融合和基因剪接：利用重组DNA技术和PCR技术也可

以在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产

生融合蛋白质。

(4)tRNA介导定点参入非自然氨基酸：通过引入非自然氨基酸

到蛋白质分子中，不但可以对蛋白质的构造有更深的了解，也可以为

生物医学的争论供给的手段。

1.蛋白质工程的学科根底、根本原理、过程与主要内容〔可以作

图关心说明〕

蛋白质工程就是以雷白质的精细构造和生物功能间的相互关系为

根底，以基因工程为手段，依据人类自身的需要，定向地改造自然蛋

白质，甚至于制造自然界本不存在的、具有优良特性的的蛋白质分子;

是由分子遗传学、构造生物学、基因重组技术、蛋白质化学和计算机

关心设计等多学科的融合而成的兴生物技术领域。

蛋白质工程的根本原理、主要内容和应用

蛋白质工程分子生物学

分子遗传学

构造生物学蛋白质的

化学修饰

基因修饰

蛋白表达

型蛋白质

的创出医

药农业食

品环保

蛋白质的构造根底雷白质的

分子设计

基于自然蛋白

质构造的设计

全蛋白

质的设计

蛋白质的

修饰表达

分子生物

学的途径

化学修饰

的途径

性质分析

构造测定

突变蛋白

质的应用

四、论述蛋白质修饰的化学途径中对功能基团进展特异性修饰的

主要类别与内容

蛋白质中不仅末端氨基酸具有氨基和竣基,很多链中氨基酸侧链

也具有羟基、筑基、氨基和竣基等能进展特征性化学反响的功能基团。

利用这些功能基团的化学反响性可以进展蛋白质功能基团的特异性修

饰。

1.多位点取代

［1］氨基保护：氨基可以被Boc（酸不稳定取代基）、Msc（碱不稳

定取代基）等基团取代。这些取代基团常用于对氨基的保护，以防止其

他反响对氨基的作用。其他反响完成后，可以分别用无水三氟乙酸和

强碱将取代基团去除。去除后，很多蛋白质仍可保存活性。〔2〕亚氨

代乙酰化：大多数氨基取代反响无法将a氨基和E氨基区分，然而亚

氨代乙酰化反响是例外。当£氨基完全被亚氨代乙酰基取代时，a氨基

几乎不被取代。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍旧保持原蛋白的可溶性

等性质。夫除这个取代基时，可用强碱处理。（3］短基的甲基酯化：

室温下，将蛋白质参加到含有乙酰氯的无水甲醇中时，竣基可以被甲

基化。甲基化的蛋白质溶液经过冰水稀释，并且用碱中和，可以使保

持其活性。〔4〕部基的氧化：半胱氨酸侧链含有简洁被氧化的端基。

殊基氧化后形成的二硫腿可以使用二硫苏醇糖被复原。而经过磺酸氧

化后得到的磺酸化半胱氨酸对进一步的氧化作用很稳定，而且可以通

过将其复原成自由筑基。

2.限制性取代

利用化学方法对蛋白质分子上