高三一轮复习生物：多种PCR技术的应用课件

PCR技术的应用在模板、引物、____________和_______存在的条件下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。每次循环包括的操作步骤为

。一、PCR原理在PCR体系中缓冲液：通常采用10mmol/LTris-HCl（pH8.3-9.0），其作用是______________________________________缓冲液中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以

，

Mg2+浓度过低时，酶活力明显降低；过高时，酶可催化非特异性扩增；K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火；明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用。调节pH,保持TaqDNA聚合酶活性。激活TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶dNTP变性、退火、延伸

若扩增DNA中部的片段，则在第3次循环中将出现目的片段，此时含有

种

类型的DNA片段。PCR循环次数与有关含量的理论值（扩增片段位于DNA中间，

起始模板分子为M）循环次数DNA分子总数非目标DNA片段数目标片段数消耗引物总数nM•2n

取足够循环次数后的反应液置琼脂糖凝胶电泳，经

染色后再用_________以及蒸馏水进行脱色，观察到蓝色DNA条带。若经10次循环后测到的目标片段数小于理论值，原因可能是

。发生非特异性扩增或扩增不同步

亚甲基蓝5M（2n-2n）M•2nM（2n+1-2）75%酒精1.模板的提取

PCR模板的制备PCR模板制备是PCR实验的首要步骤，模板制备是从待分析样本中纯化和浓缩核酸（DNA或RNA）以作为PCR扩增模板的过程。由于PCR用途多样，用于提取核酸的材料可能是全血、动植物组织、培养细胞、口腔涂片、体液、甚至是1700万年前到2000万年前的木兰叶化石。对于不同类型的样本，需要利用不同的方法进行核酸提取。

其主要步骤：裂解细胞、去除杂质、析出DNA。①物理破壁法：超声波处理、研磨法等，适用于带细胞壁细胞的裂解，破碎时需

液氮冷冻处理增加细胞壁脆性。②化学试剂：SDS可以促使细胞壁破裂，同时破坏细胞膜结构；TRIzol能迅速破碎

细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。③酶解法：蛋白酶K适用所有标本的消化处理，蜗牛酶常用于酶解真菌，溶酶菌可

以对细菌进行裂解。④煮沸法：通过煮沸进行细胞的裂解，适用于质粒DNA的提取。⑤微波法：通过微波加热使细胞裂解，可以用于真菌基因组DNA的提取。为抑制DNA被水解，可以加入_______试剂裂解细胞1.模板提取2.去除杂质可以利用__________等去污剂使蛋白变性，使核酸与蛋白质之间的结合键断裂，也可利用煮沸的方法使蛋白变性。经过离心去除细胞碎片等杂质。3.析出DNADNA溶于2mol/LNacl,形成DNA钠盐，离心后取________。核酸与蛋白质不同，其具有不溶于酒精的特性。加入经过______处理的95%酒精后轻轻搅拌后即出现丝状的沉淀。1.模板提取预冷1.抑制制DNA水解酶活性，防止DNA降解；2.降低分子运动，易形成沉淀；3.低温有利于增加DNA柔韧性，减少断裂。上清液SDS去除杂质苯酚-氯仿抽提目的为去除细胞裂解液中蛋白、多糖、酚类等杂质，分离核酸。使用苯酚-氯仿溶液处理裂解后的匀浆液，最终核酸分子溶于上层的水相，多糖、酚类等处于下层的有机相，蛋白质则沉淀于两相之间。1.模板提取高纯度两种引物方向是

的，目的基因在中间；两种引物都结合在DNA模板链的___

端，子链延伸时沿着引物向

端延伸；引物

，防止形成发卡结构两条引物之间不应存在互补序列，防止形成二聚体；引物越长，G+C比例越高，退火温度_______,引物的长度一般在18-25b，

太短则

，太长则退火温度会比较高,使TaqDNA聚合酶

活性下降。⑥

引物的5´端可以进行人为修饰，如添加

或

等。3‘3‘2.PCR引物设计原则自身不应存在互补序列越高特异性不够强限制酶的酶识别序列启动子（或终止子）序列对向

在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针。为了获得B链作探针(如图),可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是()

A.引物1与引物2

B.引物3与引物4

C.引物2与引物3

D.引物1与引物4针对训练-1：引物选择针对训练-2：引物选择为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④不同PCR类型及应用（2024年1月浙江选考22节选）（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用

连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是

。

热变性使大肠杆菌细胞破裂，模板DNA流出DNA连接酶

1.直接PCR直接从样本中扩增目的DNA，而无需核酸纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程，减少了动手操作的时间，同时可避免纯化步骤中DNA的损失。注意：细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂，从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度，因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA。2.测定未知DNA区域——反向PCR当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoRI酶切为例）。若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是______(从引物①②③④中选择，填编号)。②④3.定点突变技术———重叠延伸PCR该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2获得突变位点上游DNA片段，引物3和4进行PCR后突变位点下游DNA片段。得到的DNA片段经过变性后可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的突变DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。人体内的t-PA蛋白蛋白能高效降解血栓,但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显地能显著降低出血副作用。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因的过程。（图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增含有突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增含突变位点的下游DNA序列)。请回答：(1)已知t-PA蛋白第84位半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是

，引物C该部位的碱基是

。PCR中需要引物的原因是

。（2）重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是

。GCDNA聚合酶只能从3‘端延伸DNA链引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效3.定点突变技术——大引物PCR第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。突变上游引物下游大引物第一轮PCR××拟突变位点常规下游引物第二轮PCR常规上游引物IKK激酶由IKKα、IKKβ、IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKBβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如下图所示，分析回答：（1）在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）引物B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶Hind

Ⅲ识别序列）引物C：5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）则PCR1中使用的引物有________，PCR2中使用的引物有______和图中大引物的______（①/②）链。（2）在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入

等。PCR中尽可能提高退火温度以减少

。引物A和引物C引物B②非目标基因的获得

Taq聚合酶、dNTP(3)根据图2杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上，在遗传时遵循__________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制：

。IKKB基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，T细胞减少分离通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5’端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述错误的是（）

A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入B．PCR反应体系需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等C．第2轮PCR中，引物1与图中②结合形成两条链等长的突变基因D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4D4.构建融合基因——融合PCR阅读下列材料，完成下面小题。产肠毒素大肠杆(ETEC)能引起幼畜发生急性严重腹泻，其直接致病因子为肠毒素，包括热不稳定肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)两种。LT由两类功能性亚单位(LTA、LTB)组成，其中LTB具有免疫原性；ST包括ST1、ST2两个亚型，均为小分子多肽，免疫原性弱，构建ST1基因与LTB基因的融合表达质粒，使其表达的ST1具有免疫原性，为研制抗毒素疫苗做好上游工作。1．从ETEC中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，并设计引物：P1、P2为扩增LTB基因序列的引物，P3、P4为扩增ST1基因序列的引物。其中P2、P3中的部分是人工合成能互补的Linker(连接基团)。制备LTB-ST1融合基因的过程如下图所示。

下列叙述错误的是（

）下列叙述错误的是（

）A．PCR1和PCR2通常在一个反应体系中同时进行B．设计引物时，应该将Linker添加在P2、P3的5'端C．获得①中的两条链至少经过2轮PCR1和PCR2D．①→②过程利用Linker获得的融合基因不需要DNA连接酶A4.构建融合基因——同源重组PCR某小组为研究真菌基因m的功能，用同源重组PCR构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞

，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致

。mRNA蛋白M上不含tag标签③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有

A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在TaqDNA聚合酶的作用下延伸。结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。常用方法:①在冰上配制PCR反应液（各成分一起加入），限制TaqDNA聚合酶活性,并将其置于预热的PCR仪。②使用蜡防护层将一种基本成分(镁离子、酶、模板、缓冲液等)隔离开。在热循环时，蜡熔化把

各种成分释放出来并混在一起。③Platinum

TaqDNA聚合酶是一种结合有单克隆抗体的重组聚合酶。在常温下，抗体抑制了聚合酶

活性，在PCR反应中经过起始94℃变性以后，聚合酶活性恢复，因而使TaqDNA聚合酶具有了自动

的热启动功能。。B.C(2)重组质粒的构建

将SmaI切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降

温以促进

，形成A-m结合体。载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对(3)融合蛋白的表达①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是

。②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明

，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。融合基因成功表达受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落5.（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录（reversetranscription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。2019-nCoV核酸检测“实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l-2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其5´末端连接荧光基团（R）,3´末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：(1)结合图1和图2分析，“荧光RT-PCR”技术所用的试剂盒中通常都应该含有_____________酶、____________酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂系等。在PCR反应体系中一般都需要加入Mg2+，原因是___________________________，这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的_________、___________有关。(2)根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据

_______________________________________________________________________。新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出nCoV-2019特有序列，以避免_________（填“假阴性”或“假阳性”）的出现。(3)根据图1和图2，Taq酶作用的除了能催化DNA子链的延伸，还能_______________________。逆(反)转录TaqDNA聚合激活TaqDNA聚合酶活性中心引物TaqMan探针新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列假阳性催化TaqMan探针的水解(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与__________、_______________________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阀值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中________________________等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。扩增次数样品中病毒初始数量原料、引物和探针数量荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，也可用于RNA病毒的核酸检测。其原理是：先由病毒的RNA逆转录得到cDNA，然后对得到的DNA进行PCR扩增。在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每个DNA分子扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图）。Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法错误的是（）DA.若最初反应体系中只有逆转录而来的1个DNA分子，某次PCR

反应共产生52个等长DNA，则需加入63个荧光探针B.耐高温的DNA聚合酶可催化形成磷酸二酯键和断开磷酸二酯键C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内目标DNA含量呈正相关D.Ct值越大表明检测样本中病毒数目越多，患者的危险性越高在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为比引物的最高退火温度（Tm）再高几度[1,2]。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及引物与模板非特异性结合，因此可在PCR起始阶段促进特异性的扩增。但较高的退火温度会加剧引物与模板DNA分离，导致PCR的产量降低。为了克服这个问题，在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以获得足量的预期扩增子。当退火温度降低到最佳温度时（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循环都维持此退火温度。通过这种方法所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物。6.降落PCR7.巢式PCR在此方法中，需要设计两对引物：一对（外引物）在目标扩增区域的外侧，而另一对引物（巢式引物）对应于所扩增DNA的准确区域。第一轮PCR的产物之后作为第二轮PCR的模板如果第一对引物由于引物错配扩增出了非特异性产物，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的另一个好处是这种方法有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物，那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫不对称PCR，主要只扩增一条模板链。通常用于获得大量的单链模板。实际操作时，为了增加模板量，也可以加入一对引物，只是两条引物在浓度上应存在差异。

可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。8.不对称PCR基因芯片基因芯片技术是一种能有效地对转基因作物进行检测的新技术。以对DBN9858（转入epsps和pat基因抗除草剂玉米）的检测为例，第一步，针对待测的特定DNA片段设计引物，扩增出的特定DNA片段带上标记制成探针，经变性后通过芯片点样仪固定到杂交膜上，再经过一定的处理，便得到可用于检测的DNA芯片（如图1）；第二步，从待测植物中提取DNA作为模板，加入引物进行扩增；第三步，将扩增产物经过变性处理后铺于芯片表面，放入杂交盒中，在适宜条件下进行杂交；第四步，待反应结束后，对芯片进行清洗等处理，用仪器检测芯片上的杂交结果。利用基因芯片可以实现一次性高通量快速检测，是一种具有良好发展前景的检测手段。

(1)利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是_______________原则。对DBN9858进行检测的基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定玉米植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与玉米DNA序列高度_________（填“同源”或“非同源”）的DNA片段作为阴性对照，第4-6列可分别固定__________、_________、__________进行检测，每、列重复多次以保证结果的准确性。碱基互补配对

非同源

epsps基因pat基因

启动子（或终止子、标记基因）(2)制备探针可采用缺口平移法（如图2），即先利用DNA酶使DNA分子上产生_________（填“单链”或“双链”）缺口，再利用DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性和聚合酶活性，在缺口处的5’末端每切除一个脱氧核苷酸，同时在3’末端添加一个__________的脱氧核苷酸，最终制成所需探针。带标记

单链

(3)若该基因芯片检测有效，转基因玉米DBN9858的样本在芯片的第_