高三一轮复习生物：基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)课件

基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)生物

大一轮复习第54课时基因工程的基本工具<考点一>考点一

重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。别名：操作环境：操作对象：操作水平：工程原理：最终目的：

生物体外基因DNA分子水平基因重组【归纳定义】重组DNA技术定向改造生物性状基因工程的理论基础考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”限制性内切核酸酶载体DNA连接酶考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具1、限制性内切核酸酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）

主要从原核生物中分离纯化而来①来源：选择性必修3P71“旁栏思考”：原核生物中存在限制酶的意义是什么？提示切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。教材隐性知识考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）

主要从原核生物中分离纯化而来①来源：数千种②种类：③特点：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开专一性选择性必修3P71“旁栏思考”：限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？提示原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰教材隐性知识考点一

重组DNA技术的基本工具EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）④作用：断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键EcoRⅠ(识别GAATTC序列,在G与A之间切割)考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）⑤作用结果：SmaⅠ(识别GGGCCC序列,在G与C之间切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端中心轴线两侧中心轴线处切割一次，形成一个切口，两个黏性末端5'5'3'3'考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具GAATTCCTTAA

GG

AATTCCTTAAGGCTTAAAAT

TCGGCTTA

AAAT

TCG用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考：考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具GCTTAAAAT

TCGGCTTAAAATTCG考点一

重组DNA技术的基本工具AGATCTTCTAG

AG

GATCCCCTAGGATCTAGGAT

CTAGCCTA

GGAT

CCG用两种不同限制酶切割同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，黏性末端相同的片段可以进行连接考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具

缺口怎么办？ATCTAGGAT

CTAGCCTAGGATCCG考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具2、DNA连接酶（——”分子缝合针“）①作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。②类型：a、E·coliDNA连接酶：b、T4DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能“缝合”黏性末端来源于T4噬菌体，“缝合”黏性末端和平末端效率较低比较DNA连接酶和DNA聚合酶种类DNA聚合酶DNA连接酶不同点作用实质催化

加到已有脱氧核苷酸片段上，形成

.

催化两个

之间形成

.

作用结果催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子催化具有

黏性末端或平末端的

连接起来，形成

.

模板

.

.

相同点①化学本质都是蛋白质；②都是催化形成

.两个DNA片段磷酸二酯键不需要互补DNA片段重组DNA分子单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键需要DNA连接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用对象作用结果磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNADNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具3、载体（——”分子运输车“）作为运载工具，携带外源DNA片段进入受体细胞。①作用：质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒②种类：

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。a、来源：真核或原核细胞b、结构：环状双链DNAC、特点：能自我复制考点一

重组DNA技术的基本工具二、重组DNA技术的基本工具3、载体（——”分子运输车“）③载体应具备的条件（特点）：c、有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选a、有一或多个限制酶切割位点b、能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制通常是抗性基因，也可以是荧光蛋白基因）考点一

重组DNA技术的基本工具标记基因的筛选原理考点一

重组DNA技术的基本工具模拟重组DNA过程目的基因质粒重组DNA考点一

重组DNA技术的基本工具…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG模拟重组DNA过程通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和载体（双酶切法）：防止载体自身连接、目的基因自身环化和确保目的基因插入的方向考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定1、基本原理：不溶于2mol/L二苯胺沸水浴00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定2、实验材料：新鲜洋葱（香菜、菠菜、菜花或猪肝等）不能用哺乳动物成熟的红细胞（如猪血细胞），因为无细胞核和各种细胞器可以用鸡血细胞，需加入柠檬酸钠，防止血液凝固一、DNA的粗提取与鉴定DNA含量高、材料易得、便于提取1.取材、研磨2.过滤或离心取上清液3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定三、方法步骤提取DNA步骤一：研磨破碎细胞，获取DNA研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA①研磨时间不宜太长，也不宜太用力②可以加入适量的纤维素酶、果胶酶③若用植物叶片当实验材料，为了除去细胞中的糖，可事先黑暗处理注意事项：三、方法步骤①研磨的目的？

破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中称取约

洋葱，

，然后放入研钵中，倒入

，充分研磨。30g切碎10mL研磨液如果实验材料是鸡血细胞，获取DNA滤液的方法一样吗？用蒸馏水破碎细胞，因为血细胞在蒸馏水中大量吸水涨破。步骤二：提取DNA过滤3、实验收集的是上清液还是沉淀呢？上清液1、实验用滤纸还是纱布过滤？

纱布，为了减少DNA的损失2、低温放置几分钟的作用？抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；4、粗提取的DNA中可能会含有哪些杂质？蛋白质、多糖、RNA等杂质三、方法步骤向上清液中加入等体积的（95%）预冷酒精溶液，静置2-3min，用玻璃棒沿着同一方向缓慢搅拌，卷起白色丝状物。步骤三：析出DNA提取DNA问题2：若提取物不是白色丝状物，可能原因是什么？问题1：为什么沿着同一方向缓慢搅拌？防止DNA断裂。含较多杂质三、方法步骤1号试管2号试管丝状物(DNA)用玻璃棒搅拌加入二苯胺试剂沸水浴冷却后，观察现象不变蓝变蓝DNA的鉴定不加入加入加入2mol/LNaCl溶液2mL2mL2mL5min丝状物溶解5min2mL无若实验组颜色不变蓝，可能原因是？①实验材料的选取失误②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少

③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏三、方法步骤0.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度(1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)(

)(2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)(

)√×判断正误(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(

)×(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022·湖北，4A)(

)×分析限制酶的作用和选择将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶关键能力提升EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是__________________________和_____________________。(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。提示

用限制酶MunⅠ和Spe

Ⅰ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。考向一辨析基因工程的基本工具1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。迁移应用评价下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接√2.质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长√考向二DNA的粗提取与鉴定3.(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白

质杂质√4.(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰√基因工程的基本操作程序<考点二

>考点二

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345一.目的基因的筛选与获取---基因的结构（2）真核生物基因转录剪切、拼接同一个体不同体细胞中基因转录的起点是否相同？

考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。1.目的基因：编码蛋白质的基因，或具有调控作用的因子2、筛选合适的目的基因①从相关的已知

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用

和序列比对工具进行筛选。结构和功能清晰序列数据库2.目的基因获取方法从基因文库中获取通过人工合成利用PCR获取和扩增目的基因基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库：从基因文库中直接获取：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。与载体连接导入受体菌群用适当限制酶切割（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成mRNA（某一发育时期）逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链cDNA(cDNA)与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子。cDNA文库中的基因不含以上结构人工合成：DNA合成仪（1）前提：（2）方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取②PCR

和扩增目的基因获取b、PCR反应的条件：一定的缓冲溶液（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶）DNA模板（需含有目的基因）四种脱氧核苷酸(或dNTP）耐高温的DNA聚合酶（不需要解旋酶，DNA在高温下解旋）2种引物能严格调控温度的温控设备PCR——聚合酶链式反应PCR根据DNA半保留复制的原理PCR根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：考点二

基因工程的基本操作程序(1)什么是引物？(2)PCR技术为什么需要引物？ATCGAATCGGTT

TAGCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′5′5′DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3′引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端连接脱氧核苷酸考点二

基因工程的基本操作程序(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2(5)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？提示两种引物之间不能互补配对。考点二

基因工程的基本操作程序(4)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取②PCR

和扩增目的基因获取c、PCR反应的过程：90单链50引物72d、PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。第一次循环90℃以上，DNA双链解开50℃左右，引物与DNA结合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？第二次循环5’3’5’5’3’5’第三次循环3’5’要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物22n－12n+1－2PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过n次循环后产生等长的目的基因片段有

个。2n–2n呈指数形式扩增（n次扩增后，DNA数量约为2n）PCR结果：①n代后，DNA分子有_____个

②n代后，DNA链有_____条③第____代出现完整的目的基因

④n代后，含引物的DNA分子有_____个⑤n代后，共消耗_____个引物

⑥第n代复制，消耗了______个引物⑦n代后，完整的目的基因有____个2n2n+132n2n+1-22n2n-2nPCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所引物酶温度结果联系解旋酶催化，边解旋边复制高温变性解旋，全部解旋后再复制主要在细胞核内细胞外(主要在PCR仪内)RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）细胞内温和条件在不同温度(较高)下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链1.目的基因的筛选和获取考点二

基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：使目的基因

，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代启动子标记基因2、基因表达载体的组成及作用：【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。考点二

基因工程的基本操作程序提醒启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)基因表达载体的构建（基因工程的核心）①单酶切单酶切缺点:质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接基因表达载体的构建（基因工程的核心）②双酶切的优点:防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞（感受态）→基因表达载体导入细胞中考点二

基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞能发育成完整个体繁殖快、单细胞、遗传物质少考点二

基因工程的基本操作程序Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌植物细胞导入植物细胞表现出新性状的植物将目的基因插入染色体DNA中T-DNA植物组织培养注意：1、农杆菌转化法过程可转移的DNA特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力【说明】随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。考点二

基因工程的基本操作程序辨析：①农杆菌转化法小结：Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状

该过程经过____次拼接、____次导入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接___________________________(3)第一次导入___________________________(4)第二次导入___________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌考点二

基因工程的基本操作程序辨析：②转化：转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。考点二

基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定(如分子杂交技术)原理：抗原抗体特异性结合考点二

基因工程的基本操作程序△DNA分子杂交技术——检测目的基因是否插入15N15N变性变性探针（PCR扩增）转基因生物的DNA杂交DNA分子（PCR扩增）出现杂交带考点二

基因工程的基本操作程序△分子杂交技术——检测目的基因是否转录探针（PCR扩增）出现杂交带转基因生物的mRNA15N15N变性DNA-RNA杂交分子分析基因工程的基本操作程序接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：(1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是

。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有

。关键能力提升用于筛选含有重组表达载体的细胞启动子和终止子(2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取

并用

扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。________________________________________________________________________________。染色体DNA(基因组DNA)PCR

从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带考向三辨析基因工程的基本操作程序5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是迁移应用评价A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的

培养基中能形成菌落√6.(2024·永州三模)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。如图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如图，下列叙述正确的是A.①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分B.目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼

接前应先在目的基因两端分别引入

EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列，拼接前

载体用MfeⅠ和HindⅢ切割C.利用PCR扩增目的基因时，反应缓冲

溶液中一般要加入Mg2＋的目的是维

持渗透压稳定D.利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋

白可以大规模用于禽流感疫苗制备√1.下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是A.与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料B.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低C.因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质D.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验E.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解F.加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌G.两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中H.将提取的丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色√√√√2.下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是A.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取B.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNAC.不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端D.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键E.E.coliDNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA片段连接起来√√3.下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是A.基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等B.基因工程中用的载体大多数为天然质粒C.质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团D.必须具有自我复制能力E.具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入F.载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选√√√4.下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗

传给下一代C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止

密码子等结构D.基因表达载体的构建至少需要两种工具酶E.基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对F.诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达G.基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程√√√√√5.下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的A.农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受

体植物细胞的染色体DNA上B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌C.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内D.将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作E.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译F.某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状√√√课时精练对一对123456789答案题号123456答案BBDBDABC(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)(2)EcoRⅠ酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段PCR(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大7.(1)蔗糖参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)(2)NV基因＞突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变(3)突变体便于筛选出成功导入NV基因的细胞8.23456789答案1(1)BglⅡ、BstEⅡ

—CATTG(2)3核酸染料(3)N

2、3(4)A菌B菌分解纤维素能力比A菌更强9.一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。1.(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是A.限制酶失活，更换新的限制酶B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶123456789答案√2.(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质√123456789答案3.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色√4.(2024·衡阳调研)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。123456789答案氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是C.步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植

株作对照A.要想获得抗褐变的转基因

苹果，目的基因可选择抑

制酚氧化酶表达的基因B.实施步骤①是需要限制性

内切核酸酶和DNA聚合

酶的参与123456789√答案二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。5.(2024·衡阳三模)CRISPR－Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR－Cas系统的组成如图所示，现在CRISPR－Cas9(由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成)已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关叙述错误的是123456789答案A.CRISPR－Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化C.内切核酸酶Cas9具有专一性D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行

切割√123456789答案6.(2024·湖南师大附中二模)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。如图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法不正确的是123456789答案A.引物2的3′端序列应包含XbaⅠ

的识别序列B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母

菌株为受体C.PCR反应时，缓冲液中一般要添

加Ca2＋来激活相关酶D.引物1的5′端序列应考虑将GTG

改为ATG√123456789答案√√三、非选择题7.(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。123456789答案(1)基因S启动子的基本组成单位是___________________________。脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是_________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是___________________________________________________________________________________。EcoRⅠ123456789答案

酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有_________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是_____。酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段123456789答案PCR(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____________________________________________________________________。品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更123456789答案高，种子更大8.(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。123456789答案检测用菌株蔗糖NV酶葡萄糖(培养液中)野生型＋＋＋野生型－－－