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DB22DB22/T2081—2014鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR方法MethodoffluorescencePCRforthedetectionofYersiniapestis2014-05-04发布2014-06-01实施吉林省质量技术监督局发布I本标准主要起草人：王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、1）（最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧TAMRA易于被mercuryarcl2探针FAM–TGCAGCCTCCACCGGGAT在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，6.520mg/ml蛋白酶K量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)25mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL,加入约40mL的去离子水，混合均匀，定容至50在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O），在磁力搅拌器上剧烈7.7低温冰箱（-80℃)、冷藏冷冻冰箱（2℃~8℃和-20℃)。3在上述样品沉淀中加入560μLTE缓冲液，反复吹打使之重悬，加入混匀，65℃温育10min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，10000r/min离心15min,去上清；75%第一阶段，95℃15min，1个循环；第二阶段，94℃10s，62℃45s，40个循环；荧光收集设置在4待测样品Ct值在36

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