肠道微生态及其制剂临床应用课件

肠道微生态及其制剂临床应用肠道微生态及其制剂临床应用一、肠道微生态的重要性二、肠道微生态检测方法三、微生态制剂临床应用四、我们部分研究工作五、益生菌使用中应注意的问题简要内容肠道微生态及其制剂临床应用AnnM.O’Hara1&FergusShanahanThegutfloraasaforgottenorganEMBOReport2006;7:688-93肠道微生态是对健康状态的积极评价，根本性影响黏膜免疫系统的结构和功能微生态改变能成为各种小肠功能失调的致病原因（包括IBD），控制微生态能成为有效治疗措施微生态具有聚集代谢能力等同与器官中重要器官,受细菌对黏膜体内平衡和免疫反应扩散的条件性影响更好地理解这个隐藏的器官将揭示人类健康和感染、炎症及新生物形成的奥秘肠道微生态及其制剂临床应用

肥胖、糖尿病不能完全归功于人基因组、营养习惯和生理运动减少微生态增加个体从食物中获取能量的能力微生态控制三酰甘油命运（fate）(FIAF理论)调节微生态增加血脂多糖（LPS)水平，从而激发炎症，启动肥胖、2型糖尿病改变肠道微生态治疗或预防肥胖和糖尿病1.维持人类健康中的作用SartorRB.Gastroenterology2008;134:577-579肠道微生态及其制剂临床应用肠道菌群构成传统的培养技术：200-300species2.现代分子检测技术：1800genera和15,000-36,000species3.肠道内细菌总量：1013-1014;占粪重的60%≥10倍人体内真核细胞；≥100倍人类基因组；4.99%以上是由四个菌门组成：硬壁菌门(Firmicutes);拟杆菌门(Bacteroidetes);变形菌门(Proteobacteria);放线菌门(Actinobacteria)5.除了在胃肠道轴上的分布存在差异外，肠道表面粘附和肠腔内的菌群组成亦不同，粘膜表面厌氧与需阳菌的比率明显低于肠腔内比率SartorRB.Gastroenterology2008;134:577-579

2.肠道微生态研究进展肠道微生态及其制剂临床应用3.核心微生物组TurnbaughPJ等对成年同卵双生和异卵双生女性及其母亲的肠道菌群研究，每个个体在肠道细菌种系水平上有其独特的菌群构成，在基因水平有广泛相似性，提出“核心微生物组”（coremicrobiome）的概念在细菌基因水平上的定义，不在菌谱水平上，有共同基因和参与多种代谢的重要成分核心微生物组偏离与宿主生理状态改变密切相关，比如肥胖和消瘦Turnbaughetal.Nature2009;457:480-485肠道微生态及其制剂临床应用1.常规厌氧培养方法50-80%的细菌无法培养2.分子生物学技术基于细菌DNA分析细菌种群多样性3.16SrRNA是理想的进化标记存在于所有的微生物细胞中数据库中已有10,000多个序列二、肠道微生态检测

肠道微生态及其制剂临床应用4.人肠道菌群芯片（HIT-CHIP）监控肠道菌群Harrington

CR,etal:BMCMicrobiol.2008;8:195以细菌16S核糖体基因为基础开发一种肠道菌群快速检测微点阵技术对比长寡核酸（40-和50-mer）和短寡核苷酸（16-21mer）的微点阵性能.不断增加探针核苷酸错配的数量，确定为区分完整和错配探针所需最低核苷酸数量该微点阵的灵敏度可达每克粪便8.8×104个细菌实现在不同细菌分类学水平上对人类肠道菌群快速检测

短寡核苷酸微点阵技术提高胃肠道菌群的检出能力肠道微生态及其制剂临床应用5、代谢组学水平Claus

SP,etal:MolSystBiol.2008;4:219.肠道微生物组通过肠肝循环和肠道代谢深刻影响胆汁酸代谢（1）无菌和常规小鼠均存在明确代谢表型差异：尿中马尿酸盐和结肠上皮内的5-氨基戊酸盐在无菌小鼠体内浓度降低，棉子糖仅在无菌小鼠结肠内检测到（2）局部（肠道）和整体（生物液体、肾脏、肝脏）水平调节机体代谢表型，影响多种饮食调节和与个性化药物反应（3）细胞容积调节子如内铵盐、胆碱、肌醇等影响肾脏内环境稳定肠道微生态及其制剂临床应用6.群落水平研究高通量芯片杂交技术难以应用于群落水平的研究可应用cDNA-AFLP高通量技术进行群落水平的研究只已知部分肠道微生物的16SrRNA序列群落mRNA的克隆和测序非常困难mRNA序列与进化和功能之间的关系非常复杂肠道微生态及其制剂临床应用7.宏~组学研究以种属、人体和群落为研究对象，可在转录水平上了解微生物活性借助组学数据可详细了解肠道微生物的活性，以进一步获得代表健康肠道的生物标志肠道微生态及其制剂临床应用三、微生态制剂临床应用肠道微生态及其制剂临床应用给予37例肠癌和43例息肉摘除患者益生元（LGG和BB12）12W

结肠活检DNA损伤，增殖活性3H-标记指数（%标记细胞/隐窝细胞）粪水对上皮细胞TER和肿瘤细胞侵袭的影响外周血PBMCs中IL-2和IFN水平结果：益生元明显改变粪微生态，LGG和BB12明显增多产气夹膜梭状芽胞杆菌息肉者结直肠增殖和粪水量1)微生态制剂与大肠癌AmJClinNutr2007;85:488–96肠道微生态及其制剂临床应用Sunil等统计截至2006.2严格采用随机双盲对照研究有关益生菌治疗急性腹泻的文章34篇发现：抗生素相关腹泻的有效率52％旅行者腹泻的有效率8%其他原因腹泻的有效率34％预防腹泻发生儿童57％成人26％2)微生态制剂与腹泻LancetInfectDis2006,6:374–382肠道微生态及其制剂临床应用3)微生态制剂与炎症性肠病HedinCetal.Evidencefortheuseofprobioticsandprebioticsininflammatoryboweldisease:areviewofclinicaltrials.ProcNutrSoc.2007;66(3):307-15.肠道微生态及其制剂临床应用

BesselinkMG,etal.Lancet.2008;371(9613):651-9.4）微生态制剂与急性胰腺炎肠道微生态及其制剂临床应用肠道微生态及其制剂临床应用5.肠道和非肠道疾病中的应用肠道微生态及其制剂临床应用作者搜索PubMed,Scopus,WebofScience,andCochrane分析关于腹部手术围手术期使用微生态制剂RCTs结果9个RCTs研究涉及733患者，术后肺炎，胆管炎，任何感染以及术后住院时间和抗生素治疗时间在接受微生态制剂治疗组明显降低；但术后伤口感染率，尿路感染率，腹内脓肿和死亡率无显著差异

结论

微生态制剂能降低腹部手术后的手术后感染率

6.微生态制剂与手术后感染Doestheuseofprobiotics/synbioticspreventpostoperativeinfectionsinpatientsundergoingabdominalsurgery?Ameta-analysisofrandomizedcontrolledtrialsEuropeanJournalofClinicalPharmacology

2009.10.1007/s00228-009-0642-7肠道微生态及其制剂临床应用Fig

1

Meta分析微生态制剂对两组患者各种感染发生率的影响Fig2

Meta分析微生态制剂对两组患者抗生素使用时间的影响Fig

3

Meta分析微生态制剂对两组患者术后住院时间的影响肠道微生态及其制剂临床应用肠道微生态及其制剂临床应用四、部分研究工作

（一）乳酸菌对IL-10-/-小鼠肠屏障和微生态的影响(二）益生菌对重症胰腺炎患者肠功能及感染并发症的影响

（三）微生态制剂对大肠癌患者术后炎性反应和肠道屏障功能的影响

肠道微生态及其制剂临床应用肠炎确认与评估：一般情况观察；肉眼损伤评分；镜下组织评分；生化指标检测对照组IBD组IBD+乳酸菌组肠道菌群的检测：细菌培养技术对肠道主要细菌进行培养肠屏障功能检测：①脾脏、肠系膜淋巴结细菌检测；②Ussingcha-mbers对肠道电生理及通透性检测；③细胞间连接蛋白定位定量研究；肠吸收功能检测：①14C]Gly-Sar吸收率的测定；②PepT1定位和定量研究；淋巴细胞归巢：①MAdCAM-1、ICAM-1免疫组化测定；②PMAdCAM-1、ICAM-1、a4b7、CD3RT-PCR和WB分析；综合分析肠道微生态及其制剂临床应用1.乳酸菌调节IBD小鼠肠道菌群紊乱（一）乳酸菌对IL-10-/-小鼠肠屏障和微生态的影响2.减轻IBD小鼠结肠炎症表现3.降低结肠细胞旁路通透性及细胞旁路超微结构的破坏4.增强结肠上皮细胞紧密连接蛋白表达5.降低结肠PepT1表达及其转运功能肠道微生态及其制剂临床应用结果乳酸菌调节肠道菌群，维护肠道微生态的平衡，降低细菌移位,增强紧密连接蛋白表达，从而降低肠上皮细胞旁路通透性乳酸菌降低炎症小鼠结肠PepT1表达，下调PepT1介导的寡肽的转运，降低上皮细胞对肽类抗原可能的跨上皮细胞转运能力乳酸菌下调粘附分子MAdCAM-1,ICAM-1,CD3,anda4b7在IBD小鼠结肠异常高表达

J.Nutr.2010,140:2201–2206.AJP-GI2010,299(6):G1287-G1297JGH2011,26:405–411.DigDisSci2010,55:2505-2513.

肠道微生态及其制剂临床应用

1.两组患者入院时基本情况分析临床资料PN组EIN组性别(男/女)26/1225/11年龄（岁）58.4±19.154.3±13.1APACHEⅡ

评分8.6±0.78.3±0.5BalthazarCT评分4.3±0.93.8±0.4胆源性疾病3536酒精性12其他疾病42入院时SIRS

2624入院时MODS

78入组前出现症状平均时间

(h)24.126.4（二）益生菌对重症胰腺炎患者肠功能及感染并发症的影响肠道微生态及其制剂临床应用2.分组治疗PN组益生菌组置管时间（天）中心静脉置管13.6±1.1内镜下空肠置管15.1±1.9供热25-30kcal/kg/d25-30kcal/kg/d供氮0.12-0.15g/kg/d0.12-0.15g/kg/d抗生素需氧菌需氧菌生长抑素不用不用其他药物/益生菌制剂肠道微生态及其制剂临床应用根据患者知情同意书内容，仅在出现血培养和引流液培养细菌阳性，胰腺周围怀疑感染灶或已明确有感染时才使用抗菌素使用抗菌素为灭滴灵，环丙沙星,实验观察期间两组使用抗菌素种类和量无差异其他辅助治疗两组基本一致，未使用降低胃酸药物和胃肠动力药善宁、施他宁均不予使用，营养治疗期间不使用血浆或人体白蛋白等制剂

3.其他治疗肠道微生态及其制剂临床应用

EN配方（60kg)半量时EN部分(1d,2d)PN部分百普素（g）12610%GS(ml)1000（ml）50020%Intralipid(ml)2508.5%Novamin(ml)

500非蛋白热卡（KCal）416.5850总氮量（g）2.97全量时EN部分(3-7d)PN部分百普素（g）25210%GS(ml)1000（ml）10008.5%Novamin(ml)

250非蛋白热卡（KCal）833400总氮量（g）5.83.5肠道微生态及其制剂临床应用实施EN同时合并使用益生菌制剂（为植物乳杆菌及其代谢产物）含活菌量：108CFU/ml，交大昂立生物技术研究所提供使用剂量：每日100ml

经空肠营养管三次/d(分别在8:00,12:00,20:00时相点)注入5.益生菌制剂肠道微生态及其制剂临床应用出院标准

胰腺炎症状、体征消失体温正常，WBC正常血/尿淀粉酶正常可进食无脂半流质6.排除标准：凡需外科手术干预者，病情过重者（APACHEⅡ评分＞25分）有严重代谢性疾病者（糖尿病，高脂血症等）胰腺恶性肿瘤ERCP后急性胰腺炎，继发感染术中诊断胰腺炎者血甘油三酯>10mmol/L签订知情同意书肠道微生态及其制剂临床应用7.观察指标入院观察期始3d观察期终血/尿淀粉酶√

√√血常规√√肝肾功能√√血浆内毒素√√粪细菌基因指纹图谱√鼻胃管抽吸液细菌培养√

√肠通透性√√预后分析√√肠道微生态及其制剂临床应用

2组间上述指标均无统计学差异（P＞0.05）随时间变化，各指标变化趋势一致8.血、尿淀粉酶，血常规，肝肾功能9.治疗前后血浆内毒素变化（Pg/ml）肠道微生态及其制剂临床应用SAP早期外周血内大肠杆菌DNA的浓度明显上升经治疗后实验组大肠杆菌DNA浓度明显下降，而PN组下降并不明显10.外周血大肠杆菌DNA含量肠道微生态及其制剂临床应用11.鼻胃肠管抽吸液pH值、细菌变化分析鼻胃肠管抽吸液PN组EIN组D1(n=38)D8(n=38)D1(n=36)D8(n=36)

pH值(Mean±SE)4.5±1.84.0±1.75.1±2.14.9±1.9阳性病例数[n(%)]35(92.1%)37(97.4%)32(88.9%)31(86.1%)多种菌病例数[n(%)]24(66.7%)28(73.7%)22(66.1%)14(38.9%)*潜在致病菌病例数[n(%)]21(55.3%)19(50%)17(47.2%)11(30.6%)#n=病例数;*vsPN组D8,P<0.01;#vsPN组D8,P<0.05肠道微生态及其制剂临床应用13.肠道通透性测定结果(L/R比值)

肠道微生态及其制剂临床应用14.两组患者临床结果情况分析

PNgroup(n=38)EINgroup(n=36)低白蛋白血症14(36.84%)10(27.78%)淋巴细胞下降18(47.37%)10(27.78%)*SIRS14((36.84%))6(16.67%)*MODS7(18.42%)4(11.11%)*肺部并发症8(21.05%)3(8.33%)*导管相关性感染并发症13(34.21%)5(13.89%)*血培养阳性8(21.05%)3(8.33%)*胃肠道出血4(10.53%)0(0)*肠麻痹6(15.79%)2(5.56%)*排便次数（7d内）1.40±0.54.1±0.6*抗菌素治疗5(13.16%)2(5.56%)*APACHEⅡ评分4.5±1.33.2±1.7*BalthazarCT评分1.7±0.51.4±0.5死亡病例00*vsPN组,P<0.05EurJClinNutr.2008;62(7):923-30.IF=2.686.肠道微生态及其制剂临床应用（三）微生态制剂对大肠癌患者术后

炎性反应和肠道屏障功能的影响中华胃肠外科杂志.2010;13(7):528-31AlimentPharmacolTher.2011;33(1):50-63肠道微生态及其制剂临床应用实验对象

2006年3月至2007年3月上海交通大学附属第六人民医院普外科行根治性手术的大肠癌患者80例手术和病理证实

入选标准

结直肠癌择期手术患者；术前经肠镜活检组织病理证实；术前使用微生态制剂至少5天；术前评估能行根治性手术剔除标准术前或术中发现已属肿瘤晚期患者；急性梗阻、穿孔、出血及术前严重贫血（Hb≤60g/l）免疫系统疾病、严重心血管、呼吸系统疾病和严重代谢性疾病患者；术前经免疫治疗或化疗，近期曾服用微生态制剂；术前存在急慢性感染，或近期曾使用过抗生素.肠道微生态及其制剂临床应用微生态制剂上海交通大学昂立生物医药研究院嗜酸性乳杆菌（lactobacillusacidophilus）活菌数≥2×108cfu/g低聚果糖（Fructooligosaccharide，FOS）用法用量：2g/qd,口服肠道微生态及其制剂临床应用患者处理流程图

FlowChart

1st2nd6th9th11th16th入院▲口服微生态制剂▲手术▲取手术标本▲静脉血抽取▲继续口服微生态制剂▲粪便标本▲肠道微生态及其制剂临床应用大肠癌患者(n=81)对照组(n=40)

实验组(n=41)技术路线Ussingchamber测上皮阻抗免疫组化occludin和sIgA测定PCR检测外周血细菌DNA阳性率

粪便细菌DNA基因指纹图谱分析

临床资料分析综合分析肠道微生态及其制剂临床应用

临床指标

SIRS发生率腹腔引流管放置时间术后相关并发症发生率（切口、肺部、中心静脉导管等）术后肠功能恢复情况（首次排气时间、腹泻发生率和腹泻总天数）低白蛋白血症发生率抗生素使用时间术后发热持续时间和校正住院时间肠道微生态及其制剂临床应用两组患者术前情况比较对照组（n=40）实验组(n=41)性别（男/女）年龄（Y）BMI（kg/m2）分期（A/B/C）直肠癌根治术(例)乙结肠癌根治术(例)左半结肠切除术(例)横结肠切除术(例)右半结肠切除术(例)结肠癌根治附带脏器切除术(例)术前血白蛋白水平（g/l）术前血色素水平(g/l)术前准备时间（d）21/1965.7±9.9022．58±2.08/19/131711412337．5±3．18123.2±19.617．3±1.5229/1265.3±10.9922.82±1.8210/20/11189524239．1±3．52125.3±18.36.65±1.39肠道微生态及其制剂临床应用两组患者术中术后情况比较对照组（n=40）实验组(n=41)手术时间(min)术中出血量(ml)术中/术后输血量(ml)术后白蛋白使用量（g）中心静脉导管使用（％）术后抗生素使用种类甲硝唑（人次）青霉素类（人次）头孢菌素类（人次）喹诺酮类（人次）氧氟沙星类（人次）130．8±46.15395±234.46410±552.4145．5±24.60902031342109.5±37.45310±221.00390±574.8243.5±20.84952041133肠道微生态及其制剂临床应用两组临床情况对比

对照组实验组

P值SIRS发生率（％）腹腔引流管置放时间(d)术后外周血感染率(％)切口感染发生率(％)导管感染发生率(％)肺部感染发生率（％术后首次排气时间(d)术后腹泻发生率(％)术后腹泻总天数（d）术后低蛋白血症发生率（％）抗生素使用时间(d)发热持续时间(d)校正住院时间(d)死亡病例（人）854．7±1.49101010154．2±1.323029306.95±2.357.15±2.3020.90±3.310804．3±1.45555103.3±1.17108255.85±1.635.90±1.0218.65±2.230>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05<0.05<0.05<0.05>0.05>0.05<0.05<0.05>0.05肠道微生态及其制剂临床应用

细菌培养结果对照组实验组标本来源发生人次血液切口静脉导管痰液（n=2）（n=2)(n=2)(n=3)血液切口静脉导管痰液（n=1）(n=1)(n=1)(n=2)大肠杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌√√√√√√√√√√√√√√肠道微生态及其制剂临床应用肠上皮TJprotein和sIgA含量

结肠（各20例）回肠（14例/13例）TJprotein(%)IgA(%)TJprotein(%)IgA(%)对照组15.25±2.795.95±1.014.25±2.215.65±1.25实验组17.55±3.807.0±1.9517.33±2.087.50±0.7

P

<0.05<0.05

>0.05>0.05肠道微生态及其制剂临床应用Ussingchamber测定肠上皮跨膜电阻

结肠阻抗（Ω/cm2）末端回肠阻抗（Ω/cm2）对照组

13.7±8.23

13.13±7.91实验组

16.4±10.58

22.45±8.93

P

<0.05

>0.05肠道微生态及其制剂临床应用小结促进术后肠功能的恢复，并缩短术后发热持续时间和校正住院时间可增加结肠上皮跨膜结合蛋白occludin和sIgA表达可促进患者术后肠道菌群趋向多样化降低患者术后早期外周血细菌DNA阳性率肠道微生态及其制剂临床应用1、适应症推荐等级A（依据Level1A）治疗儿童急性感染性腹泻预防抗生素引起的腹泻预防儿童住院和其他途径感染引起的腹泻治疗乳糖不耐症推荐等级A（依据Level1B）预防和缓解回肠炎预防手术后感染预防和缓解儿童遗传性过敏疾病JClinGastroenterol2008;42:s104-8五、益生菌使用中应注意的问题肠道微生态及其制剂临床应用1、适应症推荐等级B（依据Level2B）预防旅行者腹泻预防由严重急性胰腺炎引起的败血症缓解溃疡性结肠炎降低胆固醇其他预防或辅助治疗HP预防或治疗IBSJClinGastroenterol2008;42:s104-8肠道微生态及其制剂临床应用Rautio、Soleman分别报导过乳酸菌引起肝脓肿和心内膜炎(ClinicalInfectiousDiseases1999;28:1159–1160

)可能通过变异携带耐药因子，如广泛应用，可能使耐药因子在肠道微生物内传播，大范围出现耐药菌Case1,6周男性,右心室双出口和肺动脉瓣狭窄Case2,6岁白种女性,脑瘫,小头,智力迟钝,癫痫,胃空肠造瘘,尿路感染治疗

LandMH,etal.PEDIATRICS2005,

115(1):178-181Figure1.标准乳酸菌和脓肿内细菌PFGE图.Lanes1,6,病人来源;

lanes2,7,标准LGG;lanes3,8,菌株Lc705;lanes4,9,LGATCC7469T;lanes5,10,不相关菌2、安全性肠道微生态及其制剂临床应用3、有效性多少益生菌制剂才有疗效，怎样才算达到了微生态平衡的标准？如何评价益生菌制剂的有效性？目前尚缺乏系统完整的科学资料，也较难对益生菌制剂的效用作量化评价每日服用量为106~108时，粪便中检测不到LGG每日服用量为109时，7个志愿者中有2人检测到LGG每日服用量为1010时，所有志愿者中均检测到LGG

Saxelinetal.MicrobialEcolHealthDis1991.4:209-214.Saxelinetal.MicrobialEcolHealthDis1993.6:119-1221082x10810