GB-T 47216-2026 蚕白僵病诊断技术

GB/T47216-2026蚕白僵病诊断技术前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。本文件起草单位：西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室、中国农业科学院蚕业研究所、农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心、四川省蚕业管理总站。本文件主要起草人：于滨、陈涛、马露芸、孟宪志、李春峰、潘国庆。引言蚕白僵病（SilkwormWhiteMuscardine）是由白僵菌属的白僵菌侵入蚕体所致的一种蚕类病害，蚕病死后体表被覆白色或类白色分生孢子，故称白僵病。白僵菌属于子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、虫草菌科（Cordycipitaceae）、白僵菌属（Beauveria）。其中球孢白僵菌（Beauveriabassiana）对家蚕的致病性最强，是最常见的致病菌种，可导致白僵病的典型症状；布氏白僵菌（Beauveriabrongniartii）对家蚕的致病性较弱，但在特定条件下仍可引发感染，存在局部爆发风险；白僵菌属的其他菌种自然感染家蚕的案例极少。因此，本文件中PCR检测方法采用白僵菌属通用引物，附录中仅给出球孢白僵菌的参考序列，若需鉴定其他菌种，需通过内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer,ITS）测序和系统发育分析完成。蚕白僵病是养蚕业三大病害之一，传播快、致死率高，被列为我国二类进境检疫性疫病和三类动物疫病，每年给我国养蚕业造成超亿元直接经济损失。为规范蚕白僵病诊断流程，解决行业内诊断技术碎片化、灵敏度不足等问题，提升疫病防控效率和跨境检疫公信力，制定本标准。本标准整合流行病学诊断、病原分离培养、显微形态观察及分子生物学检测技术，形成多维度诊断体系，填补了国内相关国家标准空白，对减少蚕农经济损失、推动养蚕业标准化发展具有重要意义。1范围本文件描述了蚕白僵病的临床诊断、样品采集、保存与运输，以及镜检法、病原分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量PCR检测等实验室诊断方法。本文件适用于蚕白僵病的诊断和病原的检测，涵盖家蚕幼虫、蛹、蛾各虫态，以及蚕室空气、桑叶、蚕具等相关环境样本的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1蚕白僵病：由白僵菌属真菌侵入蚕体引发的传染性病害，典型特征为病蚕死后体表形成白色菌丝和分生孢子层，虫体僵化。3.2白僵菌：属于虫草菌科白僵菌属的一类真菌，可寄生家蚕等昆虫，是引发蚕白僵病的病原。3.3分生孢子：白僵菌的无性孢子，呈球形或椭圆形，是传播蚕白僵病的主要侵染体。4缩略语下列缩略语适用于本标准。PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）ITS：内部转录间隔区（InternalTranscribedSpacer）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate）bp：碱基对（BasePairs）5临床诊断5.1流行病学蚕白僵病多发生于高温、多湿的蚕区，适宜发病温度为24℃~28℃，相对湿度需在75%以上。传染源主要是病蚕（包括幼虫、蛹、蛾）及被白僵菌污染的桑叶、蚕具、环境等；传播途径主要为表皮接触传染，亦可通过创伤传染和食下传染。白僵菌的分生孢子可通过空气、直接接触等方式附着于蚕体表面，在适宜条件下发芽侵入蚕体。该病在蚕1龄~3龄发病较为普遍，各龄蚕均可感染，感染后至发病死亡的时间因蚕龄而异，小蚕为2d~4d，大蚕为4d~6d。5.2临床症状5.2.1幼虫期病征感染初期无明显特征，仅蚕体体色稍暗、反应迟钝；随着病势进展，蚕体食桑量减少、运动不活泼，体表可出现淡色针状油渍状病斑或分散的黑褐色病斑。初死蚕体柔软且有弹性，随后逐渐变硬；死后1d~2d，先在气门及节间膜处生出白色菌丝，逐渐蔓延至全身，最终在菌丝上形成石灰状白色分生孢子层，体表被覆白色菌丝和分生孢子是蚕白僵病的标志性特征。眠期发病时，蚕体呈半蜕皮或不蜕皮状态，易腐烂（参见附录A）。5.2.2蛹、蛾期病征蛹期发病易形成僵蛹，死后不久，蛹胸部逐渐收缩凹陷，腹部环节皱缩套叠，最终干瘪变硬；部分病蛹可化蛾，但羽化后无法产卵，蛾死后尸体干瘪，足与翅膀易脱落（参见附录A）。5.3结果判定结合5.1的流行病学特点，若蚕体出现5.2所述的典型临床症状，即可判定为临床诊断阳性。6样品的采集、运输与保存6.1样品的采集将待检的蚕体（幼虫、蛹、蛾）、桑叶、蚕具擦拭物、蚕室空气沉降物等样品，分别置于无菌样品袋或冻存管内，清晰编号并填写采样单，注明采样时间、地点、样品类型、采样人等信息。采样过程中应严格遵循无菌操作原则，避免杂菌污染及样品间交叉污染。环境样品采集需符合相关规范：蚕室空气样品采用空气采样器采集，桑叶样品随机选取不同部位叶片，蚕具样品采用无菌棉签擦拭表面后置于无菌容器中。6.2样品的运输与保存样品采集后用密封袋进行二次包装，做好防渗漏处理，尽可能在24h内送至实验室并尽快处理。若24h内无法送达，需将样品放入保温箱，加入预冷冰袋密封运输，全程保持低温环境，避免样品变质或病原活力下降。样品送达实验室后，每组样品随机分成2份，一份立即用于检验，另一份冷藏于4℃冰箱中作为留样，留样保存期限为30d~60d。需长期保存的样品，可置于-20℃冷冻环境中，保存期限不超过6个月。7镜检法7.1仪器设备7.1.1光学显微镜（放大倍数不低于400倍）；7.1.2A2型二级生物安全柜；7.1.3无菌解剖工具（解剖剪、解剖刀、镊子）；7.1.4载玻片、盖玻片、无菌水、75%乙醇溶液等。7.2样片制备7.2.1血液样片用75%乙醇溶液对6.2中保存的蚕体样品表面进行消毒，用无菌解剖剪剪去蚕体尾角，滴1滴~2滴血液于洁净载玻片上，若血液过干或过浓，可滴加1滴~2滴无菌水稀释，涂抹均匀后盖上盖玻片，制成镜检样本。7.2.2体表菌丝样片取6.2中保存的病蚕样品置于无菌培养皿中，用无菌镊子或解剖刀轻轻刮取体表白色菌丝或分生孢子，置于滴有少量无菌水的载玻片上，涂抹均匀后盖上盖玻片，避免产生气泡。7.2.3环境样品样片桑叶样品：取少量桑叶组织，用无菌剪刀剪碎，置于无菌水中研磨成匀浆，取少量匀浆滴加在载玻片上，盖上盖玻片；蚕具擦拭物：将无菌棉签上的擦拭物洗脱于少量无菌水中，取上清液滴加在载玻片上，盖上盖玻片。7.3镜检与结果判定将制备好的样片置于光学显微镜下观察，放大400倍~1000倍，观察是否存在白僵菌的菌丝和分生孢子。白僵菌菌丝呈透明、有分隔，分生孢子呈球形或椭圆形，直径2μm~3μm，着生于瓶状分生孢子梗上（参见附录B）。若镜检发现上述典型形态的菌丝和分生孢子，即可判定为镜检阳性；未发现则为阴性。镜检过程中需选取多个视野观察，避免漏检。8病原的分离与鉴定8.1仪器设备与试剂8.1.1仪器设备：生物安全柜、恒温培养箱（精度±0.5℃）、高压蒸汽灭菌锅、离心机、光学显微镜等；8.1.2试剂：沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基、无菌生理盐水、抗生素溶液（抑制细菌生长）等，具体试剂配方参见附录C。8.2分离培养8.2.1无菌操作：所有操作均在生物安全柜内进行，实验用具需经高压蒸汽灭菌处理。8.2.2样品处理：取少量病蚕组织（如体表菌丝、血液、体内组织），用无菌生理盐水研磨成匀浆，梯度稀释至10-3~10-5倍；环境样品取上清液，同样进行梯度稀释。8.2.3接种培养：取稀释后的样品液0.1mL~0.2mL，均匀涂布于SDA培养基平板上，加入适量抗生素溶液抑制细菌污染，置于25℃±1℃恒温培养箱中培养3d~7d，观察菌落生长情况。8.3鉴定8.3.1菌落形态鉴定白僵菌菌落初期呈白色绒毛状，逐渐变为棉絮状，后期颜色加深至淡黄色或淡粉色，菌落直径逐渐增大，边缘整齐或不整齐。8.3.2显微形态鉴定挑取少量菌落，制备临时装片，置于显微镜下观察，确认是否存在白僵菌典型的菌丝和分生孢子形态，与7.3中的镜检特征一致。8.3.3结果判定若分离培养出符合上述菌落形态和显微形态特征的真菌，即可判定为病原分离阳性；未分离出则为阴性。9PCR检测9.1仪器设备与试剂9.1.1仪器设备：PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、移液器、恒温水浴锅等；9.1.2试剂：总DNA提取试剂、PCR反应试剂（包括Taq酶、dNTP、引物、缓冲液等）、DNAMarker、琼脂糖等，具体试剂配方及规格参见附录D、附录E，总DNA提取方法参见附录F。9.2样品DNA提取取待检样品（病蚕组织、分离培养的菌落、环境样品），按照附录F的方法提取总DNA，提取后的DNA置于-20℃保存备用，避免反复冻融。9.3PCR扩增9.3.1反应体系（25μL）：Taq酶1μL、10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP混合物2μL、上下游引物各1μL、模板DNA2μL、无菌去离子水16.5μL。9.3.2扩增程序：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃~58℃30s，延伸72℃1min，共35个循环；终延伸72℃10min，4℃保存。9.3.3阴性对照与阳性对照：设置无菌去离子水为阴性对照，已知白僵菌DNA为阳性对照，同步进行PCR扩增。9.4电泳检测制备1.5%~2.0%琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物与上样缓冲液混合后，加入凝胶上样孔，同时加入DNAMarker，在120V电压下电泳30min~40min，电泳结束后用凝胶成像系统观察结果（参见附录G）。9.5结果判定若阳性对照出现预期大小的特异性条带，阴性对照无条带，待检样品出现与阳性对照一致的特异性条带，则判定为PCR检测阳性；若待检样品无特异性条带，则判定为阴性。白僵菌PCR产物参考序列参见附录H。10荧光定量PCR检测荧光定量PCR检测可用于蚕白僵病的快速定量检测，提高检测灵敏度和特异性，具体操作流程可参照相关分子生物学检测规范，结合本标准附录中的试剂和方法执行，检测结果以Ct值判定，Ct值≤35为阳性，Ct值>35为阴性。11综合判定11.1临床诊断阳性、镜检阳性，即可确诊为蚕白僵病；11.2临床诊断阳性、镜检阴性，但病原分离阳性或PCR检测阳性，即可确诊为蚕白僵病；11.3临床诊断阴性，但镜检阳性、病原分离阳性或PCR检测阳性，判定为隐性感染，需进一步跟踪监测；11.4临床诊断阴性、镜检阴性、病原分离阴性且PCR检测阴性，判定为未感染。附录A（资料性附录）蚕白僵病的临床症状A.1幼虫期典型症状：感染后期体表出现油渍状或黑褐色病斑，死后体表逐渐覆盖白色菌丝和分生孢子，虫体僵化；眠期发病时半蜕皮或不蜕皮，易腐烂。A.2蛹期典型症状：僵蛹胸部凹陷、腹部皱缩，最终干瘪变硬；部分病蛹可化蛾，但无产卵能力。A.3蛾期典型症状：尸体干瘪，足与翅膀易脱落，无法正常产卵。附录B（资料性附录）白僵菌光镜下的图像B.1白僵菌菌丝：透明、有分隔，呈分枝状，直径1μm~2μm。B.2白僵菌分生孢子：球形或椭圆形，直径2μm~3μm，着生于瓶状分生孢子梗顶端，呈链状排列。附录C（规范性附录）病原的分离及培养所用试剂C.1沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基配方：葡萄糖40g、蛋白胨10g、琼脂20g、无菌水1000mL，pH值调至5.6~6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。C.2无菌生理盐水：NaCl8.5g、无菌水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。C.3抗生素溶液：青霉素、链霉素各1000U/mL，过滤除菌后备用。附录D（规范性附录）PCR检测所用试剂D.1总DNA提取试剂：裂解液、蛋白酶K、无水乙醇、洗脱液等，具体配方参见附录F。D.2PCR反应试剂：TaqDNA聚合酶（5U/μL）、10×PCR缓冲液（含Mg²⁺）、dNTP混合物（各2.5mmol/L）、白僵菌属通用引物（上游引物：5'-XXX-3'，下游引物：5'-XXX-3'）。附录E（资料性附录）基因组DNA的提取方法E.1取少量待检样品（约50mg），置于无菌离心管中，加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K（20mg/mL），涡旋振荡混匀，56℃水浴30min~60min，期间每隔10min振荡一次。E.2加入500μL氯仿-异戊醇混合液（体积比24:1），涡旋振荡10min，12000r/min离心10min，吸取上层水相至新的无菌离心管中。E.3加入等体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置30min，12000r/min离心10min，弃上清液。E.4用75%乙醇溶液洗涤沉淀2次，每次12000r/min离心5min，弃上清液，室温晾干沉淀。E.5加入50μL~100μL洗脱液，溶解DNA，-20℃保存备用。附录F（资料性附录）蚕白僵病PCR检测的电泳图F.1电泳图中，DNA