T∕CVMA 368-2026 鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增（RAA）检测方法

准鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增(RAA)检测方法2026-4-1实施2026-4-1实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国兽医药品监察所提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：中国兽医药品监察所、北京市朝阳区农业农村综合服务中心、百狮园动物保健科技(广州)有限公司。本文件主要起草人：王楠、徐磊、张柳青、艾青、朱小洁、刘军、辛凌翔、孙伟峰、李俊平、张晓茜、张莹辉、张媛、彭小薇、胡君宜、程君生。本文件规定了鼻疽伯氏菌重组聚合酶恒温扩增(RAA)检测方本文件适用于疑似感染鼻疽伯氏菌的马属动物鼻分泌液、咳出液和溃疡的脓液及其血液的核酸检仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本实验室生物安全通用要求兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范ddH₂O:双蒸水(double-distilledwater)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)mM:毫摩尔每升(millimolar)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)RAA:重组聚合酶恒温扩增技术(recRNA:核糖核酸(ribonucleicacid)有试剂均用无DNA/RNA酶污染的容器分装，所有溶解和稀释用水均用无核酸酶水。工25.2引物及探针：配制10μM工作液，引物及探针序列参见附录A,用于设计引物的鼻疽伯氏菌HP基因参考序列见附录B。5.3CTAB提取缓冲液(pH8.0):10g/LCTAB,0.7mol/LNaCl,0.05Na₂EDTA。5.670%乙醇。5.8TE缓冲液(pH8.0):10mmol/LTris-HCI(pH8.05.9PBS缓冲液(pH7.4):8gNaCl,0.2gKC1,1.42gNa₂HPO₄,0.27gKH₂PO4,定容至1L。5.10启动剂：15%聚乙二醇，280mM乙酸镁。5.11RAA荧光反应单元：5.12阳性对照：制备方法参见附录C。5.13阴性对照：pUC57空载体质粒6.54℃高速冷冻离心机(8000g以上)。6.7冰箱：2℃~8℃和-20℃。处理按照GB19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护集疑似样品必须采取严格生物安全防护措施，疑似样品采集和保存应符合NY/T541的要求。3保定马匹，用75%酒精棉片擦拭清洁马匹鼻孔周围皮肤，无菌拭子插入鼻腔深部，轻轻擦拭并慢慢旋转至少3圈，将拭子置于1mL的PBS缓冲液样品保存管，折断拭子杆，保留拭子头，盖紧管盖，4℃保存备用。用无菌吸管吸取咳出液至离心管，优先选取黏稠、带血丝或脓性的部分，体积约1mL～2mL。若75%酒精清洁溃疡表面，脓液较多时，用无菌注射器抽取脓液0.5mL~1mL至离心管；脓液较少时，用无菌拭子轻轻擦拭并慢慢旋转至少3圈，将拭子置于1mL的PBS缓冲液样品保存管，折断拭子杆，保留拭子头，盖紧管盖，4℃保存备用。无菌注射器采集血液5mL~8mL至抗凝管，4℃保存备用。将含有鼻拭子、咳出液和溃疡脓液的保存管在涡旋振荡器上充分混匀，4℃下3000g离心5min,取上清液，转移至1.5mL灭菌离心管中即用，血液样品无需处理。7.3.1采用核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核酸提取方法。7.3.2将7.2.5处理后的样本上清液，加入600μLCTAB提取缓冲液(pH8.0),涡旋振荡混匀后于2℃~8℃孵育15min,期间颠倒离心管2～3次。12000r/min离心5min,取上清液，加入500μLDNA抽提液，上下颠倒离心管2～3次，涡旋振荡混匀，12000r/min离心5min,取上层水相，加入0.7倍体积异丙醇，上下颠倒离心管2～3次，4℃静置30min,4℃12000r/min离心3min,小心弃去上清液，加入700μL70%乙醇，重悬沉淀，12000r/min离心1min,小心弃去上清液。打开管盖，室温挥发液体，在1.7～2.0,DNA模板适宜用于RAA检测。待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，按照n+1分别配制反应液，充分混匀后分装。RAA反应体系的配置见附录D中表D.1。为避免反应提前启动，RAA反应体系配置时，启动剂不RAA反应程序见附录D.2。将启动剂与体系充分混匀，放入恒温荧光检测仪，设置选定FAM作4光对数增长，相应的无报告T值。实验结果有效，否则应重新进行试验。被检样品无荧光对数增长，或无报告T值，则判定被检样品15min<T值<20min,判定为可疑，结果可疑样品重新检测，如重复检测结果仍然15min<T值<20min,则判定为鼻疽伯氏菌核酸阳性，否则为阴性。5(规范性)为与类鼻疽伯氏菌相区别，鼻疽伯氏菌选择HP基因作为靶基因，特异性引物基因引物序列(5′→3')预期片段大小/bpHP基因TCTCAGTCGCCAGCATGTTATCTCATTACCCGCGCGCATGCCATCCTCCAATTGCTTATTCGTGTTGACTGGCG6(资料性)CTCGCGCGTAATTCAGCAGTGTCCCGAATAGCTCCAATTGCTTATTCGCCCGACTCCAAGAGCTTGTCCTTGAACAGGATGGCATGCGCGCGGGTAATGCCGGGTTCGCGTTCTTTCGCCCACTTCTCGACAAGGGCGGCGAGGTGGCCGCGCGATCAAAACCCCGTGAG7(资料性)阳性对照的制备合成HP基因(附录B.1)片段，克隆至pUC57载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数(DNA拷贝/μL=[6.02×10³×DNA浓度(ng/μL)×10-9]/(DNA碱基数×660)),即为阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取10³拷贝/μL稀释度作为阳性对照，