T∕CVMA 366-2026 淀粉卵涡鞭虫病诊断技术

准T/CVMA36淀粉卵涡鞭虫病诊断技术Diagnostictechniquesforamyloodiniosis2026-4-1实施2026-4-1实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广州双螺旋基因技术有限公司\中山大学和华南农业大学共同提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：广州双螺旋基因技术有限公司、华南农业大学、中山大学。本文件主要起草人：石磊、但学明、李安兴、李言伟、莫泽权、李志成、常彦磊、张璜、陈灏挺、孔明慧。本文件规定了淀粉卵涡鞭虫病(Amyloodiniosis)临床检查、样品采集、淀粉卵涡鞭虫形态学鉴定和仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本眼点淀粉卵涡鞭虫隶属于肉足鞭毛门(Sarcomastigophora)腰鞭毛目(Dinoflagellata)淀粉卵涡鞭于水面或氧气充足的区域。严重感染时，病鱼在12h内窒息死亡。实时荧光PCR:实时荧光聚合酶链式反应(Real-timepolymerasechainreCt值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)工2淀粉卵涡鞭虫病俗称“海水鱼天鹅绒病”,是由眼点淀粉卵涡鞭虫寄生生虫病。该病主要集中在4月到7月或9月到10月，在水温高于20℃、水体交换量少的密集养殖区域选择符合5.1临床症状的患病鱼。梨形静止的黑色虫体(参见附录A图A.1),大小为30μm～80μm,可判定为可疑。7.2当发现可疑病鱼时，需继续观察或采样进行病原学鉴8.1.4荧光定量PCR仪。38.2.1除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。8.2.2水生动物病原体基因组提取试剂盒。8.2.3荧光PCR反应液：按照不同的实时荧光PCR平台的说明书选取推荐的荧光PCR扩增试剂。8.2.4引物和探针：参照眼点淀粉卵涡鞭虫18SrRNA特异性基因片段(序列见附录B.1),设计眼点淀粉卵涡鞭虫荧光PCR扩增特异性引物及探针序列，见附录C。8.2.5阳性对照：含有眼点淀粉卵涡鞭虫18SrRNA基因片段的重组质粒按照附录B中B.2制备，也可以使用其他经过确认的阳性质控品。8.2.6阴性对照：已被确认为未感染眼点淀粉卵涡鞭虫的阴性样品。在核酸提取区进行。取鱼体表的虫体，使用商品化的核酸提取试剂盒进行提取。反应体系的配制应在专门的区域进行，反应体系的配制见附录D中表D.1。实时荧光PCR反应程序见附录D.2。8.4结果判定8.4.1试验成立条件当阳性对照的FAM检测通道有典型的S型扩增曲线且Ct值≤30,阴性对照和空白对照的FAM检测通道均无扩增曲线且Ct>40或者无值时，试验成立；否则试验无效。8.4.2结果判定被检样品FAM检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值≤36,判定为眼点淀粉卵涡鞭虫核酸被检样品FAM检测通道Ct值≥40或无Ct值，未见的S型扩增曲线，判定为眼点淀粉卵涡鞭虫核酸阴性。被检样品FAM检测通道36<Ct值<40,判定为可疑，可疑样品需重新进行一次检测。如重新检测后仍出现上述结果，可判定为阳性；如重复检测后无Ct值或者无“S”型扩增曲线，可判定为阴性。9综合判定9.1如果病鱼黏液或鳃丝在显微镜下观察到疑似虫体，则判定为可疑。49.2如观察到疑似虫体，并用TaqMan实时荧光PCR方法检测结果为阳性，则可确诊为眼点淀粉卵涡鞭虫。病鱼同时符合5.1中的症状，则确诊为淀粉卵涡鞭虫病。5(规范性)6(资料性)眼点淀粉卵涡鞭虫18SrRNA基因片段序列B.1眼点淀粉卵涡鞭虫18SrRNA基因片段参考序列(GenBankAccessionNo.AF080096.1)5'-CTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTATAAACTTCTTCACGGTGAAGCTGCGAAAAGCTCATTAAAACAGTTACAGTTTATTTCCCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACACGCTTCCACGGAAGGGTTGTGTTTATTAGTTACAGAACCAACCCAAGTCTTCGACTTTGATAACCGTACGAATCGCATGATCTCAATCGGCGATAGATCATTCAAGTTTCTGACTTCCGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGTGGCACTGACGGGTAACGGACCGGAGAGGCAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGAATCCTGACGCAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGTGCATCCATGTTCAATGAATAGAATTTAAATCTCTTTGTGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGCTGTTGCGGTTAAAAAGTGCCGGAGACGACCGGTCCGCCCACTGGGTGTGCATCTGGTTCGGCTTGGACGTCTTCTGCACTTCATTGTGTGGGGCGGGATTCGAGACCTTTACTTTGAGGAATCAAGCAGGCCGACGCCTTGAATACATTAGCATGGAATAATAAGATAGGAGTTGGTTTCTAGAAGCAAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAAAGACGGACTACTGCGAAAGCATTTTTGATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTACCATGCCGACTAGAAATTGGAGGTCGTTTTATTGTAGGACCCCTTCAGCAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAACATAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCTATACGTAACTTCGGTAACGTAGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGTGTGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCACTCAACGAGTTTCTTGACCTTGCCCGAGAGGGTTGGGTAATCTTCTCAAAGTGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTGAACGAGGAATTCCTAGTAAGCTGCTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATAACTCGGACTGCTGCAGTCTTCTGCTTCTGAAAACTGTGGCGGAAAGTGTGGTACCTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGA注：粗体为引