选修三基因工程操作程序鬻2讲课文档

选修三基因工程操作程序鬻第1页，共35页。（优选）选修三基因工程操作程序鬻第2页，共35页。原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的，边_________边_________编码区是间隔的、_____的，先_____后_____相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码转录翻译转录翻译第3页，共35页。①目的基因的获取②基因表达载体的构建（核心）③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测与鉴定四个步骤第4页，共35页。一、目的基因的获取编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第5页，共35页。1)基因文库？1.从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库2)基因文库的种类:种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库第6页，共35页。基因文库的构建方法①基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存第7页，共35页。②cDNA文库的构建-----逆转录法：提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存第8页，共35页。思考？真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？第9页，共35页。真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子第10页，共35页。基因组DNA文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第11页，共35页。2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第12页，共35页。1.变性（95℃）双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________氢键单链DNA2.复性

(55℃)温度降低，

与DNA模板结合，形成局部______。双链引物3.延伸（72℃）在

的作用下，从引物的

连接

，合成与模板互补的DNA链。3′端脱氧核苷酸Taq酶第13页，共35页。PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第14页，共35页。PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等第15页，共35页。3.人工合成法

在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？第16页，共35页。反转录法：杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA双链DNA(cDNA)目的基因的mRNA某种酶DNA聚合酶反转录酶人工合成法（真核生物）第17页，共35页。课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库第18页，共35页。二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因第19页，共35页。表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第20页，共35页。基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子表达载体同一种一个切口两个黏性末端第21页，共35页。注意：①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。第22页，共35页。三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第23页，共35页。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第24页，共35页。1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。②钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物第25页，共35页。1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉第26页，共35页。2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法①程序目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物第27页，共35页。3、将目的基因导入微生物细胞过程：Ca2+处理受体细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。方法——Ca2+处理法用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？第28页，共35页。三、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第29页，共35页。四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测第30页，共35页。1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性第31页，共35页。第32页，共35页。1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法—