副干酪乳杆菌上调多胺代谢调节巨噬细胞分化抑制溃疡性结肠炎的机制研究

副干酪乳杆菌上调多胺代谢调节巨噬细胞分化抑制溃疡性结肠炎的机制研究【摘要】目的和意义：探讨副干酪乳杆菌上调多胺代谢调节巨噬细胞分化抑制溃疡性结肠炎的机制。方法与思路：按体重将C57B/L6小鼠随机分为5组:生理盐水对照组，DSS模型组，副干酪乳杆菌灌胃治疗组，美沙拉嗪灌胃阳性药物对照组，美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组，每组各6只。造模并治疗7天后，记录小鼠大便性状、体重变化及便血情况，计算疾病活动指数（DAI）。采用ELISA检测小鼠血清中TNF-α和IL-10含量；采用HPLC检测血清中SPD和SPM的含量；采用HE染色观察结肠病变处病理结构改变；采用免疫组织化学技术和Westernblot法检测ODC1、AMD1、Smox、SRM、CD163、F4/80、CD206、iNOS的表达水平；采用流式细胞术来检测外周血中CD163、F4/80和CD206的表达水平。创新性：溃疡性结肠炎被世界卫生组织列为现代难治疾病之一，而副干酪乳杆菌作为益生菌的一种，其对治疗溃疡性结肠炎有一定的作用，但其治疗机制仍不明确。本项目首次采用副干酪乳杆菌探究上调多胺代谢调节巨噬细胞分化从而抑制溃疡性结肠炎的机制。【关键词】副干酪乳杆菌;小鼠模型;溃疡性结肠炎MechanismofLactobacillusParacaseiup-regulatingPolyamineMetabolismandRegulatingMacrophageDifferentiationtoInhibitUlcerativeColitis[Abstract]Objectiveandsignificance:ToinvestigatethemechanismofLactobacillusparacaseiup-regulatingpolyaminemetabolismandregulatingmacrophagedifferentiationtoinhibitulcerativecolitis.Methodsandideas:C57B/L6micewererandomlydividedinto5groupsbyweight:physiologicalsalinecontrolgroup,DSSmodelgroup,mesalazinepositivedrugcontrolgroup,lactobacillusparacaseiintragastricadministrationgroup,mesalazinecombinedwithlactobacillusparacaseiintragastrictreatmentgroup,6ineachgroup.After7daysofmodelingandtreatment,theweightchangesofmicewererecorded,stoolcharacteristicsandbleedinginthestool,diseaseactivityindex(DAI)wascalculated.ThecontentsofTNF-αandIL-10inserumofmiceweredetectedbyELISA;ThecontentsofSPDandSPMinserumweredetectedbyHPLC;ThepathologicalchangesofcolonlesionswereobservedbyHEstaining;TheexpressionlevelsofODC1、AMD1、Smox、SRM、CD163、F4/80、CD206andiNOSweredetectedbyimmunohistochemicaltechniqueandwesternblot;TheexpressionlevelsofCD163,F4/80andCD206inperipheralbloodweredetectedbyflowcytometry.Creativity:UlcerativecolitisislistedasoneofthemodernrefractorydiseasesbytheWorldHealthOrganization,andLactobacillusparacaseiisaprobiotic,ithasacertaineffectonthetreatmentofulcerativecolitis,butthemechanismremainsunclear.Inthisproject,lactobacillusparacaseiwasusedforthefirsttimetoinvestigatethemechanismofup-regulatingpolyaminemetabolismandregulatingmacrophagedifferentiationtoinhibitulcerativecolitis.[Keywords]Lactobacillusparacasei;Mousemodel;Ulcerativecolitis立题目依据1.1国内外研究现状分析溃疡性结肠炎（UC）是消化内科常见疾病，难治且极易复发，存在进一步的癌变风险，治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治疾病之一[1]。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等，研究发现其发病可能和体内的肠道菌群失调，炎症因子、基因蛋白的表达，内黏液层的改变等有关[2]。大量研究显示，免疫细胞功能异常、细胞因子网络失调是UC结肠局部炎症反应的重要发病机制[3-5]，随着UC发病机制的揭晓，临床上治疗UC的方法也逐渐增多并且取得一定的疗效，但仍然无法完全治愈UC。因此，揭晓UC的发病机制是治愈UC的前提和关键。多胺（Polyamine,PA）是普遍存在于动植物所有组织和所有细胞类型中的脂族聚阳离子，其被证明在调节细胞凋亡、细胞分裂和分化、细胞增殖、DNA和蛋白质合成、基因表达、体内平衡和信号转导等方面具有重要作用[6]。体内多胺合成开始于精氨酸的降解，其与精氨酸酶（arginase,ARG）发生反应被分解为尿素和鸟氨酸（ornithine），后者在多胺合成限速酶鸟氨酸脱羧酶（ornithinedecarboxylase,ODC）的催化下脱羧生成腐胺，腐胺再经与精脒合成酶和精胺合成酶催化分别生成亚精胺（Spermidine,SPD）和精胺（Spermine,SPM）。ODC是多胺合成中的限速酶，它会导致腐胺水平的升高，从而影响M1型巨噬细胞分化。此外，亚精胺和精胺可以调节巨噬细胞促炎细胞因子的转录翻译[7]，因此，疾病病变部位多胺合成的增加可被认为是炎症发生的产物[8]。另外，精胺已被证明可以抑制人单核细胞中促炎性细胞因子的合成，以及一氧化氮（NO）介导的肠损伤[9]。最近报道，骨髓特异性Odc（Odc∆mye）缺失小鼠，其骨髓来源的巨噬细胞对诱导巨噬细胞向M1型分化的刺激物（包括幽门螺杆菌、柠檬酸杆菌或LPS+IFN-g）的反应性显著增加，并促进M1型巨噬细胞相关基因的转录和翻译表达[10]。综上所述，多胺代谢可能与巨噬细胞的分化密切相关，可能对抑制溃疡性结肠炎的发生有重要作用。巨噬细胞（Macrophage，Mφ）是组织内的一种吞噬细胞，在组织稳态、炎症反应调节和宿主防御中起着重要作用，具有吞噬、抗原呈递、免疫防御和等多种功能，是机体重要的固有免疫细胞种类之一。巨噬细胞通过不同的极化类型参与炎症的发生发展和消退过程，发挥不同的免疫功能来保护机体的稳态[11]。根据刺激因子的不同，巨噬细胞可被极化为促炎性的M1型巨噬细胞与抗炎性的M2型巨噬细胞[12]。M1型介导宿主防御的特点是通过产生大量促炎细胞因子（TNF-α，IL-1、IL-6和IL-23）发挥抑菌和机体免疫防御功能，而M2型巨噬细胞通过分泌细胞外基质成分，并表达高水平的抗炎细胞因子（IL-4、IL-10和IL-13）参与组织修复和肿瘤进展[13-15]，发挥抗炎作用和促进组织修复功能[16-18]。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可修复受损的黏膜屏障为肠道内有益菌提供良好的生长环境，通过竞争性抑制作用来防止致病菌的过度繁殖，以强化局部肠道及全身免疫力，增强肠道机能[19]。益生菌治疗UC的可能机制是益生菌可以通过刺激肠道内的免疫机能来促进抗炎因子的分泌，从而抑制有害细菌的生长[20]。某些病原体可以削弱或破坏肠道黏膜的屏障功能，甚至损坏或穿透黏膜壁，而益生菌则可以有效预防或修复这种损伤。益生菌的主要作用机制包括竞争粘附位点和肠道内的营养物质，维持肠道正常的微生物群平衡，从而促进肠黏膜的免疫耐受，增强肠黏膜屏障功能以及干扰肠道炎性反应。研究表明，益生菌通过PI3K/Akt和NF-κB信号通路，抑制TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的产生，促进抗炎因子IL-10和TGF-β的产生，从而改善UC的症状[21]。在UC活动期，结肠黏膜固有层中T细胞数量上升，这在UC早期会介导巨噬细胞极化为M1型，加速肠黏膜损伤，而极化的巨噬细胞通过分泌IL-1、IL-6、TNF-α等能破坏肠黏膜屏障的细胞因子和趋化因子，然后聚集中性粒细胞至炎症部位释放蛋白水解酶破坏组织而导致溃疡的发生[22]，从而促进炎症发生、发展。益生菌对巨噬细胞表型具有调节作用，其通过调节多胺影响中性粒细胞或单核细胞分泌TGF-β、IL-4和IL-10[23]，而TGF-β、IL-4和IL-10促进巨噬细胞向抗炎表型M2型极化[24]，从而发挥抑制炎症反应，维持微环境的稳态。因此，本课题组将通过葡聚糖硫酸钠（DextraSulfateSodium,DSS）来建立溃疡性结肠炎小鼠模型，研究副干酪乳杆菌上调多胺代谢调节巨噬细胞分化抑制溃疡性结肠炎的机制。1.2实验目的及意义益生菌是一类能定植于人体肠道并改善微生态平衡，有益于宿主健康的活体微生物[25]，其广泛存在于人体口腔、肠道、奶酪和泡菜等发酵食品中，具有悠久的食用历史，为食源安全性的菌株。目前，临床上用益生菌治疗的疾病涉及肥胖、腹泻、炎症、癌症和高血压等多种疾病的预防和治疗，并取得良好的效果。益生菌可以有效抑制肠道中有害菌生长，是因为益生菌自由生长就可形成肠粘膜生物屏障，从而降低有害菌对肠粘膜的攻击。溃疡性结肠炎（uicerativecolitis，UC）又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，其病程迁延，易反复发作，且有癌变倾向，被WHO列为现代难治病之一[26]。近年来，UC的发病率持续上升，流行病学统计显示欧洲北部UC发病率最高，约为0.243‰[27]，且在亚洲，其发病率也逐年增加[28]。而我国UC发病率这些年也上升到了0.02‰，且主要以中、青年人群为主[29,30]。有相关文献表明，UC的发生与多胺代谢失衡有关，多胺代谢中精胺氧化酶（Smox）将精胺还原成亚精胺进而产生过氧化氢，引起氧化应激损伤，如细胞凋亡和DNA的损伤。相关报道显示Smox在M2型巨噬细胞中上调表达[31]，且课题组前期研究显示副干酪乳杆菌可抑制结肠癌上皮细胞多胺代谢尤其是Smox表达。因此，我们推测副干酪乳杆菌可能通过上调多胺代谢调节巨噬细胞分化从而抑制溃疡性结肠炎。1.3创新点UC的主要病变特点是结肠的弥漫性损害和肠道菌群失调，但病因和发病机制仍不明确。巨噬细胞是机体免疫细胞之一，其通过不同极化类型参与炎症的发展和消退过程，研究表明，IL-4、IL-10、TGF-β促进巨噬细胞向M2型分化，从而抑制炎症的发生。而益生菌可通过调节多胺影响中性粒细胞或单核细胞分泌IL-4、IL-10、TGF-β，副干酪乳杆菌作为益生菌的一种，并且对治疗UC有一定的作用，但其治疗机制仍不明确。本项目首次采用副干酪乳杆菌探究上调多胺代谢调节巨噬细胞分化从而抑制溃疡性结肠炎的机制。实验方案2.1实验内容2.1.1副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后对机体多胺代谢的影响采用预防性灌胃副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后，收集小鼠外周血，肠道组织和脾脏等。HE染色检测组织病理变化；免疫组织化学法和Westernblot法检测肠道组织多胺代谢相关酶（AMD1、ODC1、Smox和SRM等）的表达；高效液相色谱法检测外周血多胺代谢物（SPD、SPM）含量。统计学分析副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后对机体多胺代谢的影响，以及机体多胺代谢对小鼠溃疡性结肠炎影响的优劣。2.1.2副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后对机体巨噬细胞分化及功能的影响采用预防性灌胃副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后，收集小鼠外周血，肠道组织和脾脏等。免疫组织化学法和Westernblot法检测肠道组织巨噬细胞分化相关蛋白（F4/80、CD206、iNOS和CD163等）；流式细胞术检测外周血中巨噬细胞分化出的相关蛋白（CD163、CD206和F4/80等）；ELISA检测外周血中血清TNF-α、IL-10的含量。统计学分析副干酪乳杆菌治疗小鼠溃疡性结肠炎后对机体巨噬细胞分化及功能的影响。2.2技术路线2.3方法与材料2.3.1溃疡性结肠炎模型建立分组动物：无特定病原体的C57BL/6成年雄性小鼠25只，6~8岁周龄；DSS分子量为35000~4000，MP公司；美沙拉嗪（缓解颗粒；商品名：艾迪莎）葵花药业产品；大便隐血试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）；将25只SPF级C57BL/6成年雄性小鼠随机分为5组，每组5只并编好号。①生理盐水对照组（NS组）：每日对小鼠使用无菌生理盐水灌胃0.2mL/d。造模前2d开始灌胃，共9d。②DSS模型组（DSS组）：给予5%DSS溶液自由饮用7d。③副干酪乳杆菌R3灌胃治疗组：造模前2d开始灌胃1×109CFU/mLR3菌悬液0.2mL/d，共9d。④美沙拉嗪灌胃阳性对照组：每日用量0.52mg/g，药物浓度52mg/ml,造模前2d开始灌胃，共9d。⑤美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌R3菌灌胃治疗组：R3菌悬液浓度调至1×109CFU/mL，将美沙拉嗪重悬至浓度为1×109CFU/mL，造模前2d开始灌胃，共9d。2.3.2溃疡性结肠炎模型的制作将DSS溶解于超纯水中，按20:1的比例配置成5%的DSS溶液。其中NS组自由饮用超纯水7d，DSS模型组使用提前配置好的5%DSS溶液自由饮用7d，两组每日使用生理盐水灌胃。为了保证实验结果，该试剂为现配现用。每日喂养前先观察小鼠毛发亮度及精神是否萎靡，然后记录各个小鼠的体重，后灌胃，取出粪便收集至编好号的EP管中，取出粪便过程中观察小鼠的粪便形状及性状，最后将收集好的粪便用于隐血实验检测。每日须同一时间重复该实验步骤，且要保证小鼠的DSS液不能中断。至第7d末时若小鼠出现精神萎靡、食欲减退、毛发失去光泽、体重显著下降、明显血便或是隐血实验强阳性则造模成功。造模第8d上午先将小鼠眼球取血后折颈法处死小鼠，将小鼠结肠取出后置于生理盐水溶液中反复冲洗干净后置于滤纸上将肠壁展开，在距肛门1cm处取远端结直肠组织放置于4%多聚甲醛内固定、包埋、切片、HE染色。实验期间每天记录小鼠大便形状、精神状态、小鼠体重与隐血情况。2.3.3疾病活动指数（DAI）评分结肠炎疾病活动指数根据实验动物的大便粘稠度（正常，稀便，水样便）、体重下降百分率及分辨潜血情况（正常，潜血阳性，潜血强阳性）三种情况进行综合评分，将3项结果的分数之和除以3即得到结肠炎DAI值，即结肠炎DAI=（分辨形态得分+体重下降百分率+分辨潜血情况得分）/3。每日实验开始前使用电子天平称量每只小鼠的体重并收集其粪便，计算体重下降百分率=[体重下降百分率=（第0天的体重-第你天的体重）/第0天的体重×100%]，按照下表中的标准来对小鼠体重下降的百分率对小鼠打分，观察收集小鼠的粪便形状并打分，记录结果。对每只小鼠使用粪便隐血试剂盒后检测潜血的情况做好记录。根据大便性状，体重及潜血情况进行DAI打分。得分大便性状体重下降（%）大便隐血/肉眼血便0正常无阴性1软便1~5阴性2松散6~10隐血阳性3腹泻11~15隐血阳性4稀便＞15肉眼血便▪正常大便：成型大便；松散大便：不粘附于肛门的糊状、半成型大便；稀便：可粘附于肛门的稀水样便2.3.4检测指标收集①收取结肠组织样本，将从小鼠体内取出的结肠放置于事先在冰上预冷过的1640培养基中，注射器吸取超纯水反复轻柔地冲洗结肠肠腔，直至清洗干净为止，后在每只小鼠距肛门1cm处截取一段为1cm肠管，将其放入4%多聚甲醛溶液固定在之后用于HE染色和免疫组化检测。一部分westernblot检测多胺相关蛋白的表达及巨噬细胞功能标志物在结肠中的表达水平。②眼球取血，检测外周血中巨噬细胞功能标志物的表达，血清中TNF-α和IL-10等细胞因子的含量及精胺和亚精胺的含量。③收集心、肝、脾、肺、肾、胸腺等组织冻存管分装，-80°C冰箱保存。2.3.5副干酪乳杆菌的培养R3菌由广东省医学分子诊断重点实验室和广东省教育厅医学生物活性分子研究重点实验室提供。将菌株经过复苏然后在MRS琼脂平板上传代，每次传代16h左右，传两代后挑取MRS琼脂平板上的单个菌落将其接种于MRS液体培养基中，37°C厌氧活化16-18h至对数期生长期末，使用PBS洗涤细胞沉淀两次，调整细胞浓度为1*109CFU/mL左右。2.3.6苏木精-伊红（HE）染色检测结肠多聚甲醛固定后酒精梯度脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，包埋后中性树脂封片，进行HE染色，高倍显微镜下选取视野观察小鼠结肠形态和病理损伤。2.3.7免疫组化法检测结肠组织多胺代谢限速酶和巨噬细胞功能标志物的表达取结肠组织进行石蜡切片常规并利用二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水，加入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0），并将其放置于微波炉内使用微波辐射10min进行抗原修复。PBS洗5次后，再将山羊血清进行室温封闭10min，随后再加入一抗（ODC1、AMD1、Smox、SRM、CD163、F4/80、CD206、iNOS）4℃过夜;PBS洗涤后，加入酶标二抗，37℃孵育30min后加入显色剂（DAB），流水冲洗后封片观察。2.3.8Westernblot法检测结肠组织多胺代谢限速酶和巨噬细胞功能标志物的表达取结肠组织组织样本，裂解并提取结肠组织中的总蛋白，充分裂解后，吸取蛋白上清，用BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白样品进行定量检测。用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，电泳结束后将凝胶中的蛋白通过电转移转移到PVDF膜上，TBST清膜一次后用含有5%牛血清白蛋白的封闭液室温封闭60min。弃封闭液再使用TBST清洗膜三次，随后加入一抗（iNOS、CD206、Smox、SRM、CD163、F4/80、ODC1、AMD1）4℃过夜，使用TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育2h;后再用TBST清洗3次，然后加入发光试剂显色成像，根据蛋白灰度值分析蛋白表达水平，实验重复3次，取均值。孵育一抗4℃冰箱过夜;分析条带密度。2.3.9ELISA检测外周血清中IL-10、TNF-α的含量取小鼠外周血清样本，根据ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-10、TNF-α水平。2.3.10高效液相色谱法检测多胺相关含量取小鼠外周血清样本，通过高效液相色谱法（HPLC）检测血清中亚精胺（SPD）和精胺（SPM）的含量。2.3.11流式细胞仪检测巨噬细胞功能标志物外周血清样本分组加入流式管中，每管100μL。抗体（PerCP-Cy5.5-F4/80、PE-CD206、FITC-CD163）需要避光加入再检测的，于4℃反应30min。反应完后使用3mlPBS清洗１次，后用PBS重悬即可直接上机进行分选；再用4％甲醛的PBS固定后检测，检测用的荧光染色最多课保留48h。流式细胞仪检测最终结果使用FlowJo软件进行分析。2.3.12统计学方法采用SPSS23.0统计软件处理，使用（x±s）表示，t检验分析应用于各组间比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。2.4前期研究基础本项目是在课题组硕士研究生学位论文副干酪乳杆菌抑制UC的机制研究下形成的。前期研究发现副干酪乳杆菌能显著抑制Th17细胞并抑制UC发生、发展，对UC疾病有明显的治疗作用。3.可行性分析3.1理论可行性通过前期研究基础发现副干酪乳杆菌对UC疾病有明显的治疗作用，本项目在前期研究基础上进一步研究副干酪乳杆菌对上皮细胞多胺代谢的影响，并探讨该过程中其对巨噬细胞功能的调控作用。3.2技术可行性本项目所需的仪器设备都具备，且参与人员基本掌握了细菌传代、细胞培养、小鼠灌胃、WesternBlotting、Elisa等。3.3条件可行性本项目在东莞市医学活性分子开发与转化重点实验室完成。实验室具有标准的细胞培养室以及分子生物学所需的仪器设备，且所有大型仪器均实行资源共享。与本项目密切相关的有细胞培养室、高速冷冻离心机、超净工作台、CO2细胞培养箱、琼脂糖凝胶电泳和SDS电泳装置等等。4.创新性分析UC的主要病变特点是结肠的弥漫性损害和肠道菌群失调，但病因和发病机制仍不明确。巨噬细胞是机体免疫细胞之一，其通过不同极化类型参与炎症的发展和消退过程，研究表明，IL-4、IL-10、TGF-β促进巨噬细胞向M2型分化，从而抑制炎症的发生。而益生菌可通过调节多胺影响中性粒细胞或单核细胞分泌IL-4、IL-10、TGF-β，副干酪乳杆菌作为益生菌的一种，并且对治疗UC有一定的作用，但其治疗机制仍不明确。本项目首次采用副干酪乳杆菌探究上调多胺代谢调节巨噬细胞分化从而抑制UC的机制。5.预期实验结果①与DSS模型组相比，副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组的DAI评分明显降低，且美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组明显低于副干酪乳杆菌灌胃治疗组。②ELISA结果显示，与DSS模型组相比，副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组的TNF-α含量明显降低，IL-10含量明显增高，且美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组TNF-α含量明显低于副干酪乳杆菌灌胃治疗组，IL-10含量明显高于副干酪乳杆菌灌胃治疗组。③HPLC结果显示，与DSS模型组相比，副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组的SPM含量明显降低，SPD含量明显增高。④HE染色结果显示，与副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组相比，DSS模型组结肠粘膜完整性极差，粘膜下基层大量炎性细胞浸润。⑤免疫组织化学和Westernblot结果显示，与DSS模型组相比，副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组小鼠结肠组织CD163、CD206和Smox的表达显著增高，而iNOs和F4/80的表达显著降低。⑥FCM结果显示，与DSS模型组相比，副干酪乳杆菌灌胃治疗组和美沙拉嗪联合副干酪乳杆菌灌胃治疗组小鼠外周血CD163、CD206表达显著增高，而F4/80的表达显著降低。参考文献李军祥.溃疡性结肠炎中西医结合治疗策略[C].中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.第二十九届全国中西医结合消化系统疾病学术会议论文集.中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会:中国中西医结合学会,2017:539-543.LiuYi,ZhangRun,YanKe,ChenFanfan,HuangWeiyi,LvBingke,SunChengmei,XuLimin,LiFeng,JiangXiaodan.Mesenchymalstemcellsinhibitlipopolysaccharide-inducedinflammatoryresponsesofBV2microglialcellsthroughTSG-6.[J].Journalofneuroinflammation,2014,11:135.FordAlexanderC,KhanKhurramJ,SandbornWilliamJ,HanauerStephenB,MoayyediPaul.Efficacyoftopical5-aminosalicylatesinpreventingrelapseofquiescentulcerativecolitis:ameta-analysis.[J].Clinicalgastroenterolog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