甘肃不同产地甘草中有效成分的含量比较研究

甘肃不同产地甘草中有效成分的含量比较研究摘要：目的：建立甘肃省不同甘草产地甘草中最主要的三种成分：甘草酸、芹糖甘草苷、甘草苷含量的高效液相色谱测的定方法。方法：采用ZORBAX

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XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)和ZORBAX

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C18保护柱(20mm×4.6m，5μm)；流动相0.5%乙酸-水（A）-乙腈（B），并且对其进行程序洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为254nm和276nm，进样量5µL。结果：测得甘肃不同产地同年生栽培的甘草中甘草酸、芹糖甘草苷、甘草苷的含量分别在19.75～1975.20µg/ml（r=0.9999）、5.50～550.00µg/ml（r=0.9978）、9.04～903.80µg/ml（r=0.9902）范围内与各自的峰面积值形成明显线性关系。从测得的数据可以计算出三种成分的平均回收率分别为98.75%、101.03和95.50%，RSD值分别为2.3%、3.1%和1.9%（n=6）。结论：不同产地同栽培年限的甘草中甘草酸、芹糖甘草苷及甘草苷的含量存在差异。关键词：甘草；甘草酸；芹糖甘草苷；甘草苷；高效液相色谱法甘草属于蝶形花亚科多年生草本植物，最常用传统中药之一[1]，始载于《神农本草经》[2]，还可称其为国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子等。李时珍在《本草纲目》第十二卷中写到，在众多的中草药中，甘草是药中君子，在古代可以解七十多种丹药的毒，可以解一千两百多中草药的毒，可以对众多中药中起到调和的作用，李时珍将其比作了“国之重臣”，在传统的中药中，都把甘草以“药王”称之[3]。甘草属于平性药物，味甘[4]对人的脾胃有非常好的作用，有清热解毒，止咳化痰的功效[5]。甘草中的主要化学成分以三萜皂苷类和黄酮类为主，除了三萜皂苷类和黄酮类以外，还有香豆素、生物碱、氨基酸、挥发性成分和多糖等[6]。其对肝脏、脾脏等具有一定的改善及修复作用[7]，芹糖甘草苷和甘草苷属于黄酮类。多种活性成分使甘草具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗肝损伤、免疫调节、抗糖尿病等多种药理作用[8]。我国是世界甘草的主产地之一，从全世界来说,甘草大概有30多个种类,从我国来说，我国的甘草主要生长在东北，华北以及西北少部分地区[9]，甘草的主要生长地有内蒙古、甘肃、新疆、东北等地方[10]。我国高质量的甘草主要分布在西部以及西北地区[11]。应用在中药中的甘草主要有乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草、黄甘草四种，其中对乌拉尔甘草的使用最多。我国以乌拉尔甘草为代表的甘草主要来自新疆安和宁夏，其中胀果甘草和光果甘草较少，且原产地都来自内蒙古[12]，对于内蒙古来说为全国各地提供优质的甘草种子，也是其非常重要的产业之一[13]。中药的质量和影响质量的因素一直备受关注，有研究表明不同地方生长的中药，随着生长环境以及年限上的差异，中药在质量上也会有很大的差异[14]。甘草作为最常见的中药材，近年来，围绕甘草质量所受影响因素的研究日益成为当前中药饮片领域的热点问题之一。不同产地甘草的品质差异大，本研究以高效液相色谱法测定甘肃主要产区甘草中甘草酸、芹糖甘草苷、甘草苷主要有效成分的含量，以探究不同产地对甘草质量的影响，为评定甘草药材质量提供一定的依据。1.仪器与材料 1.1仪器及试剂实验所用仪器及试剂见表1，表2表1所用仪器仪器名称品牌型号HPLC系统美国（安捷伦1200）超声波清洗仪（功率：250W；频率：40kHz）中国昆山（KQ5200）纯水机美国（Milli-QAdvantageA10）电子天平（十万分之一）瑞士（梅特勒XS105DU）表2所用试剂试剂来源乙酸（分析纯）天津大茂乙醇（分析纯）天津大茂乙腈（色谱纯）山东禹王水（超纯水）自制甘草酸标准品中国药品生物制品检定所（北京）批号110731-201115芹糖基甘草苷标准品上海永恒生物科技有限公司，批号FB-50001甘草苷标准品中国药品生物制品检定所（北京）批号111610-2011041.2材料从甘肃七个主要产区收集了甘草的样品，所有样品均为豆科植物甘草的干燥根及根茎，它们经甘肃中医药大学药学院杨扶德教授鉴定为植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch。样品具体产地及信息见下表，表3。表3甘草样品来源产地样品编号酒泉瓜州县Ⅰ酒泉金塔县Ⅱ白银景泰县Ⅲ张掖高台县新坝乡Ⅳ陇西首阳镇王家磨村Ⅴ陇西首阳镇Ⅵ酒泉肃州区下河清乡Ⅶ2.方法2.1色谱条件采用ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)和ZORBAX

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C18保护柱(20mm×4.6m，5μm)，流动相A：0.5%乙酸-水，流动相B:乙腈。线性梯度洗脱0-6min，20-30%B；6-8min，30-42%B；8-14min，42-50%B；14-19min，50-60%B；19-21min，60-80%B；21-25min，80%B；25-27min，80-20%B。流速为1.0ml/min。检测波长：254nm和276nm。柱温为35℃，单次样品进样量：5µL。2.2供试品溶液的制备称取甘肃省不同产地的甘草样品粉末约0.1g，将其放置于离心管中，然后加入1.5ml精量的70%乙醇水溶液,称得其重量。密封后放在温度为20℃～25℃的超声提取仪中，超声30分钟，静静放置等待其冷却、称重，同时用70%乙醇水溶液补足减少的重量，然后将溶液摇匀。高速离心4分钟（10000r/min），对上清液进行过滤操作，对过滤完的液体残渣重复提取两次，最后将实验中得到的上清液混合在一起，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到的即为供试品溶液。2.3对照品溶液的制备精密称取甘草酸对照品19.75㎎、芹糖基甘草苷对照品5.50㎎、甘草苷对照品9.04㎎，分别置于10ml容量瓶中，分别加70%的乙醇溶液定容至刻度，即得三种成分的对照品溶液。2.4对三种成分的线性关系分析精取体积适宜的以质量浓度为单位的对照品溶液，对溶液进行稀释，使其成系列质量浓度的对照品溶液，按照“2.1”项下条件进样，测定峰面积，在实验过程中甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷的质量浓度梯度做为横坐标（X，mg/ml），对应峰面积为纵坐标（Y），绘制出标准曲线，通过计算以及分析可以得出甘草酸的线性回归方程为y=6541.1361x-69.70433（r=0.9999）；芹糖基苷草苷的线性回归方程为y=9321.73488x+162.06936（r=0.9978）；甘草苷的线性回归方程为y=9802.73488x+259.41532（r=0.9902）。结果表明甘草酸在线性范围19.75～1975.20µg/ml、芹糖基甘草苷在线性范围5.50～550.00µg/ml、甘草苷在其线性范围9.04～903.80µg/ml内呈现出比较明显的线性关系。2.5甘草中各种成分的稳定性试验精确称取编号为Ⅰ的甘草药材粉末，对所称取的药品粉末，分别进行“2.2”项方法制备稳定性试验供试品溶液，静置0、4、6、8、12小时，按“2.1”项下色谱条件分别测定甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷的含量，其所对应的相对标准差值依次为1.6%、1.8%和1.9%（n=6），计算结果表明3个分析物在12小时内稳定性良好。2.6对甘草中各种成分进行重复性试验精确称取适量的样品编号为Ⅰ的甘草药材粉末，进行六次操作。分别按照“2.2”项方法制备重复性试验供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定,记录峰面积。计算甘草酸、芹糖基甘草苷和甘草苷的相对标准差分别为1.2%、2.3%和1.8%，计算结果显示此方法重复性良好。2.7对所选取仪器的精密度测试精密吸取样品编号为Ⅰ的供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件测定，进行六次操作，并对峰面积做记录。计算甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷的相对标准差分别为0.87%、0.91%和1.2%，从实验显示的结果可以看出，本实验中所采用的各种仪器的精密度以及其状态良好。2.8对甘草的加样回收率测试精密称定已经测定好的甘草药材粉末6份，每份约0.1g，分别加入精密称取的甘草酸对样品1.5mg、芹糖基甘草苷样品0.75mg、甘草苷样品0.75mg，用“2.2”项下方法配制供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，并对峰面积做记录，对其回收率和相对标准差进行计算。计算结果得甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷三种成分的平均回收率分别为98.75%、101.03和95.50%。三种成分的相对标准差分别为2.3%、3.1%、1.9%。从计算结果可以看出，此方法回收率良好，得到的结果比较可靠。2.9测定不同产地甘草样品精密称定0.1g甘肃省7个不同产地的甘草样品，按“2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件对甘肃省不同产地甘草中的三种成分的含量进行测量。对每一个甘草样品进行三次测量，并对峰面积进行记录，用外标法计算三个分析物在甘草中所占的比重。色谱图见图1。图1甘草样品色谱图1.甘草酸2.芹糖基甘草苷3.甘草苷3.结果3.1甘肃省不同产地甘草中甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷的含量比较本研究以高效液相色谱法为测定方法，测定甘肃省七个甘草产地的甘草中甘草酸、芹糖基甘草苷、甘草苷三种成分的含量，将其做一个比较。实验所得的结果如表4所示；通过相关的实验以及测定，得到三种成分在甘草中的平均含量范围分别为：甘草酸1.26～2.88%；芹糖基甘草苷：0.02～0.44%；甘草苷0.27～1.76%。甘草中三种成分含量比较，7个产地中陇西首阳镇（样品编号Ⅶ）的甘草质量相对较好。表4三种成分含量结果样品编号甘草酸含量（mg/ml）芹糖基甘草苷含量（mg/ml）甘草苷含量（mg/ml）甘草酸含量（%）芹糖基甘草苷含量（%）甘草苷含量（%）Ⅰ0.280.0040.291.260.021.30Ⅱ0.380.0580.061.710.260.27Ⅲ0.480.0500.172.160.220.77Ⅳ0.500.0520.392.250.231.76Ⅴ0.460.0350.352.070.161.58Ⅵ0.640.0570.372.880.261.67Ⅶ0.340.0970.251.530.441.133.2应用新复极差法进行含量差异比较由表5可以看出，陇西首阳镇甘草酸含量最高与其他6个地方的甘草酸含量差异显著性达到α=0.05水平；张掖高台县新坝乡、白银景泰县及陇西首阳镇王家磨村3个产地甘草酸含量无显著性差异与其他产地有差异；酒泉金塔县和酒泉肃州区下河清乡两地甘草酸含量无显著性差异与其他产地有差异；酒泉肃州区下河清乡和酒泉瓜州县甘草酸含量差异不显著。由表6，可以看出酒泉肃州区下河清乡甘草中芹糖基甘草苷含量最高与其他6个地方的含量差异显著性达到α=0.05水平；陇西首阳镇、酒泉金塔县间、白银景泰县及张掖高台县新坝乡间芹糖基甘草苷含量无显著性差异；由表7，可以看到张掖高台县新坝乡甘草中甘草苷含量最高与陇西首阳镇、陇西首阳镇王家磨村的无显著性差异和酒泉瓜州县和酒泉肃州区下河清乡甘草中甘草苷的含量无显著性差异，其余产地都在α=0.05水平上有显著性差异。（相同字母表示含量之间无显著性差异，不同字母表示含量之间有显著性差异）表5甘草中甘草酸含量显著性差异比较产地甘草酸含量平均值（mg/g）差异显著性（0.05）陇西首阳镇（Ⅵ）0.64a张掖高台县新坝乡（Ⅳ）0.50b白银景泰县（Ⅲ）0.48b陇西首阳镇王家磨村（Ⅴ）0.46b酒泉金塔县（Ⅱ）0.38c酒泉肃州区下河清乡（Ⅶ）0.34c,d酒泉瓜州县（Ⅰ）0.28d表6甘草中芹糖基甘草苷含量显著性差异比较产地芹糖甘草苷含量平均值（mg/g）差异显著性（0.05）酒泉肃州区下河清乡（Ⅶ）0.097a酒泉金塔县（Ⅱ）0.058b陇西首阳镇（Ⅵ）0.057b张掖高台县新坝乡（Ⅳ）0.052b白银景泰县（Ⅲ）0.050b，c陇西首阳镇王家磨村（Ⅴ）0.035c酒泉瓜州县（Ⅰ）0.004d表7甘草中甘草苷含量显著性差异比较产地甘草苷平均含量（mg/g）差异显著性（0.05）张掖高台县新坝乡（Ⅳ）0.39a陇西首阳镇（Ⅵ）0.37a陇西首阳镇王家磨村（Ⅴ）0.35a酒泉瓜州县（Ⅰ）0.29b酒泉肃州区下河清乡（Ⅶ）0.25b白银景泰县（Ⅲ）0.17c酒泉金塔县（Ⅱ）0.06d4.讨论按照2015版药典的要求，甘草酸含量>2.0%,甘草苷含量>0.5%,将7个产地含量百分比进行对比，只有酒泉金塔县栽培品两者含量均低于药典含量限度，其可能原因分析，甘草是喜生于半干燥、温寒带气候，且具有很强的抗旱、抗寒、耐热及耐盐碱的性质。酒泉金塔县的气候属于典型的温带干旱大陆性气候，很适合甘草的种植[15]，但所采收的这批药材质量却不佳，可能有三点：第一，生长年限少，栽培甘草的生长年限以3～4年生为佳[16]，此批甘草为两年生，因此生长年限少导致有效成分含量的累积达不到药典要求；第二，土地的重复利用导致土壤的营养成分大量流失，也可能影响栽培甘草中有效成分的含量。酒泉金塔县栽培品种甘草酸和甘草苷的含量都低于药典规定，但其中芹糖基甘草苷含量相对于其他产地较高，其原因有待进一步研究，可能存在某种转换机制。

参考文献：郭立强;李熙;刘谦;杨健;马娜;郭毅.一测多评法比较不同产地甘草中6种有效成分含量[J].中国现代应用药学,2019,v.36,47-51.冯毓秀,林寿全.甘草的本草考证及研究概况[J].时珍国药研究,199张友波;徐嵬;杨秀伟;杨鑫宝;王文全;刘亚明.RP-HPLC法同时测定不同产地甘草中9个主要成分的含量[J].药物分析杂志,2013,v.33,43-48+58.庄步辉,张蕾.浅谈甘草的功效与用法[J].内蒙古中医药,2011,30(22):41.高静芳.浅谈甘草的功效与现代药理研究.中国中医药现代远程教育,2011,9(18):63-64.孙琛.甘草的化学成分研究进展[J].科技资讯,2020,18(02):64-65.陈秋钰.不同产地甘草药材中甘草酸含量的比较