实验二、常用培养基的制备、消毒与灭菌

实验二常用培养基的制备、消毒与灭菌一、实验目的1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法。3.掌握玻璃器皿的包扎与洗涤。4.了解常用灭菌方法的基本原理及应用范围，掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。常用灭菌方法很多，一般可分为加热、照射和使用化学药品等方法。加热灭菌法分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160-170℃），时间要长（1-2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧的将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。三、实验材料蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、纱布、胶头滴管、全自动灭菌锅四、实验方法与步骤1、玻璃器皿的清洗——注意事项和方法（1）用过的器皿应立即洗涤（2）含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇到有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。（3）载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡2小时，用清水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。（4）洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。2、器皿包扎（1）培养皿：洗净烘干的培养皿每6-8套（或根据需要而定）叠在一起，用报纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后灭菌。（2）吸管、移液管：如图一所示洗净烘干的移液管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉，以防在使用时造成污染。每支移液管涌一条宽约4-5cm的纸条，以30-50°的角度螺旋形卷起来，移液管的尖端在头部，另一端用剩下的纸条打成一个结，以防散开，标上容量，若干支包扎成一束进行灭菌。使用时，从移液管中间拧断纸条，抽出移液管。（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起到过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。图一：移液管的包扎方法图二：棉塞的制作过程图三：三角瓶的包扎方法3、分组配制培养基（1）配制高氏一号培养基300ml。（培养放线菌）配方：可溶性淀粉20gNaCl0.5g、KNO31g、K2HPO4·3H2O0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g琼脂15-25g水1000mlpH7.4-7.6（2）配制牛肉膏蛋白胨培养基500ml（培养大肠杆菌）配方：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g加水定容至1000ml调PH至7.4-7.6其中300ml培养基倒入500ml的三角锥形瓶+6g琼脂，包扎待灭菌后用来倒平板、斜面。其余200ml液体培养基平均分装入4个锥形瓶，包扎待灭菌。（3）YPD培养基1000ml（培养酵母菌）配方：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml，调pH至5.0其中500ml培养基平均分装至500ml的三角锥形瓶+2%琼脂，包扎待灭菌后用来倒平板。其中200ml培养基平均分装至500ml的三角锥形瓶+2%琼脂，包扎待灭菌后用来倒斜面。其余300ml液体培养基平均分装入4个锥形瓶，包扎待灭菌。（4）包扎材料：试管，培养皿，涂布棒，吸管，枪头盒等。（5）灭菌。（6）摆斜面，倒平板，放冰箱。4、方法步骤（一）培养基的制备与分装①称量按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。②熔化在沸水浴锅中加热熔化。③调pH④过滤趁热用多层纱布过滤（这步一般不用，除去有大量不溶物）⑤分装将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。⑥加棉塞培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。⑦为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。（二）高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103－206kPa时，湿度可达121.3-132℃操作方法：①在灭菌锅中盛蒸馏水直至高水位灯亮；将用试管分装好的培养基、包装好的培养皿等玻璃器械放入灭菌器内；②旋紧上盖，设定灭菌条件：103kPa，121.3℃，开始灭菌；③加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气5分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3℃，维持20分钟后，排气至压力显示“0”时，慢慢打开盖子。如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。（三）倒平板、摆斜面①灭菌完毕，将试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。②在超净工作台上将三角瓶中无菌培养基倒入无菌培养皿中③将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。④将培养基放入4℃冰箱待用。五、注意事项：高压蒸汽灭菌法：第一，无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。第三，定期检查