《胡椒瘟病病原物PCR检测技术规程》标准文本征求意见稿

1T/HNBXXXX—2026胡椒瘟病病原物PCR检测技术规程本文件规定了胡椒瘟病病原物（Phytophtoracapsici）的术语和定义、检测方法、结果判定、结果记录、样品保存。本文件适用于胡椒种苗及大田植株上的胡椒瘟病病原物的PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胡椒瘟病blackpepperphytophthorafootrot由辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici）引起的胡椒卵菌病害，又称胡椒基腐病。3.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR先高温变性，使模板DNA成为单链；接着降温退火，使单链与引物通过碱基互补进行结合；再中温延伸，在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使新链沿引物方向合成延伸；然后循环扩增，通过多次重复变性、退火和延伸过程使靶标片段以几何倍数扩增。4检测方法4.1原理三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Yptl)在疫霉属（Phytophthora）的物种间存在丰富的变异，而在物种内却高度保守，可以为疫霉菌的PCR检测提供理想的靶序列。根据胡椒瘟病病原菌Yptl设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期230bp的DNA片段，判断样品中是否携4.2主要器材与试剂4.2.1主要器材组织研磨器、台式离心机、冰箱、PCR检测仪、电泳仪、凝胶成像仪、冰箱、剪刀、镊子、样品密封容器、1.5mL离心管、研磨杵、可调量程移液器（0.1μL～2.5μL，0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL）、吸头、0.2mLPCR管等，其中接触样品的器材应是洁净4.2.2主要试剂4.2.2.1通用要求/试剂纯度等级除另有规定外，所有试剂的纯度均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合GB/T6682要求。4.2.2.2DNA提取试剂T/HNBXXXX—20262），4.2.2.3PCR反应试剂见表1，或采用同类型的PCR扩增试剂或试剂盒。其中PCR引物的序列如下：4.2.2.4凝胶检测试剂4.3操作步骤4.3.1样品采集按照NY/T3816的相关规定进行田间诊断，对于带有疑似胡椒瘟病症状的植株，选择病健交界部位的叶片5片。样品应放入密闭容器内，室温存放时间不宜超过48h，长期保存应置于-70℃及以下温度环境。取样信息填入表A.1。4.3.2DNA提取4.3.2.1待验样本DNA制备模板。冷藏贮存不宜超过3h，长期保存应在热处理4.3.2.2对照样本DNA制备以人工接种发病的胡椒叶片为阳性对照、以健康叶片为阴性对照。DNA制备方法同4.3.2.1。4.3.3PCR反应4.3.3.1PCR反应体系PCR反应体系按照表1的规定配制，或采用同类型的试剂及试剂盒依照产品说明书配制。以胡椒瘟表1PCR反应体系用量(μL)2.52.52.00.50.54.3.3.2PCR扩增程序T/HNBXXXX—202634.3.4PCR产物检测用TAE电泳缓冲液制备1%的琼脂糖凝胶,按比例将loadingbuffer和PCR产物混匀后加至样品孔5结果判定根据PCR产物凝胶电泳图中是否出现230bp条带判定检测结果。检测结果仅在阳性对照出现目的条带且阴性对照、空白对照均未出现目的条带时有效。若泳道出现目的条带则判定结果为阳性，代表该样品携带胡椒瘟病病原菌；若泳道未出现目的条带则判定结果为阴性，代表该样品不携带胡椒瘟病病原菌。（见表2）表2检测结果判定表1是否是2是否否3否4是6结果记录与档案保存检测结果填入表A.1。7样品处置阳性样品应保存90d，以备复核。保存期满后须进行灭活处理。T/HNBXXXX—20264（资料性）胡椒瘟病病原菌分子检测报告表胡椒瘟病病原菌分子检测报告表见表A.1。表A.1胡椒瘟病病原菌分子检测报告表）：）：）：T/HNB