5第三章生物材料的预处理和液-固分离

第三章

生物材料的预处理和液-固分离

第一节生物材料的预处理

生物活性物质来源动物植物微生物组织、器官、细胞及代谢产物存在部位：胞外胞内（胞浆、质膜或器膜、细胞器内）生物材料生物活性物质特点1、含量低如胰岛素在胰脏中的含量为0.02%，胆汁中胆红素含量为0.05~0.08%。2、杂质多

3、易变性失活富集生物活性物质于细胞、发酵液或酶转化液中杂质仍比较多：细胞、未用完营养成分、蛋白质副产物、色素、金属离子及其他代谢产物等预处理（pre-treatment）：去除影响目的产物提取的大部分杂质，使提取工序顺利进行。降低生物活性物质生产成本微生物工程基因工程酶工程细胞工程一、选择预处理方法的依据

1、生物活性物质来源、存在状态

“胞外”

“胞内”——细胞破碎前体（如酶原）——1）活化、保护，分离纯化；

2）提取，活化，纯化质膜或器膜——溶剂溶解浸提

生物活性物质存在部位与它的生物活性密切相关生物活性物质的存在方式与其生物功能密切相关，一般情况下，可以根据活性物质的生物功能推断其存在部位和分布方式一、选择预处理方法的依据

2、后续工艺要求经过预处理和固－液分离后，一般要求得到滤液澄清、pH适中、有一定浓度的目的生物活性物质。如后续采用离子交换方法处理，则对滤液中无机离子、灰分含量、澄清度方面要求较高；如采用溶剂萃取，则要求蛋白质含量较低，以减轻乳化现象；如采用结晶方法，则还需要经过脱色处理一、选择预处理方法的依据

3、目的物稳定性

可被材料中酶、微生物破坏，还可能受酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线作用改变活性。防止生物活性物质的失活作用放在首位如青霉素稳定性差，发酵液酸化pH严格控制在4.8~5.2，低温；如蛋白质类药物，则要求防止其高级结构破坏；二、动物材料的预处理

绞肉机将事先切成小块的组织绞碎形成组织糜许多蛋白和酶可以从颗粒较粗的组织糜中提取出来一般情况下：先用粗孔径的绞，再用细孔径的绞；有时可能还需要多次进行；速冻组织也可以在冰冻状态下直接切块绞。二、动物材料的预处理

实验室用的组织捣碎匀浆机高压匀浆机用绞肉机，一般细胞并不破碎，一些胞内产物不能有效地提取，须通过特殊的匀浆才行。

实验室常用玻璃匀浆器和组织捣碎器，工业上可用高压匀浆器三、发酵液（细胞培养液）的预处理培养液预处理要出去的两大类杂质：无机盐类：不仅影响成品质量，而且在采用离子交换法提取时，由于树脂大量吸附无机离子而减少对目的物的交换可溶性胶状物质：核酸、杂蛋白、多糖。这些杂质不仅使培养液粘度增加，液固分离速度受影响，而且还会影响后续的分离纯化操作2去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作1改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固-液分离主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂预处理的目的加热是最简单和经济的预处理方法，但只适合对热稳定的生物活性物质。（一）细胞及蛋白质的处理1、变性沉淀蛋白变性的其它方法：大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、重金属盐（如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等）和表面活性剂天然蛋白质分子受到某些物理的或化学的因素影响时生物活性丧失、溶解度降低、不对称性增高以及其他的一些物理化学常数发生变化，这个过程就称为变性作用2、凝聚和絮凝预处理对象：细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞碎片以及蛋白质等胶体粒子培养液中的胶体颗粒的表面一般都带有电荷。带电原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。胶粒保持分散状态的原因：胶粒带有相同电荷，产生排斥作用，阻止了粒子的聚集胶粒表面的水化作用，形成水化层，阻碍胶粒间的直接聚集凝聚作用(coagulation)指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。如何使细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子聚集？在发酵液中加入具有相反电性的电解质：①中和胶粒电性，降低双电层排斥力。②离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。

影响凝聚作用的主要因素：无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+凝聚机理常用凝聚剂

发酵液（培养液）中大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷）。

常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂Al2（SO4）3·18H2O（明矾）AlCl3·6H2OFeCl3ZnSO4MgCO3常用的金属氧化物类凝聚剂Al(OH)3Fe3O4Ca(OH)2石灰等絮凝作用(flocculation)当往胶体悬液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈地吸附在絮凝剂表面的活性功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附不同的颗粒，使胶粒间产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤，这一过程称为絮凝作用。絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团。影响絮凝剂絮凝效果的因素（1）絮凝剂分子量：分子量越大，链越长，吸附架桥效果就越明显；但是分子量过大，絮凝剂在水中的溶解度降低（2）絮凝剂用量：浓度较低时，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果；但是浓度过高反而引起吸附饱和，在胶粒表面上形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，降低了絮凝效果（3）溶液的pH：pH会影响离子型絮凝剂功能团的电离度，提高电离度可使链分子上同种电荷间的电排斥作用增加，链从卷曲状态变为伸展状态，发挥最佳架桥能力。（4）搅拌速度：刚加入絮凝剂时，搅拌速度快能使絮凝剂迅速分散，发挥絮凝作用；但当絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团。3、去除杂蛋白质的其它方法

等电点沉淀

蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去各种沉淀剂沉淀某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀在酸性溶液中加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、鞣酸、过氯酸等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+形成沉淀吸附在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。例如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体等黏附在其中而除去。

加入吸附剂如活性碳，可以去除热原（二）多糖的去除黏多糖的去除黏多糖可以和一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等形成季铵盐络合物而沉淀，因而可以通过向培养液中引入这些物质使多糖沉淀去除当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难。可用酶将它转化为单糖例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速

1、离子交换法

2、沉淀法

（三）高价金属离子的去除对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子在后期采用离子交换法时，这些离子会降低树脂的交换容量。沉淀法

（三）高价金属离子的去除钙离子：常采用草酸钠或草酸镁离子：去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去铁离子：可采用黄血盐（亚铁氰化钾），形成普鲁士兰(亚铁氰化铁)沉淀四、植物材料的预处理

植物提取方法：溶剂提取法微波提取法超声提取法超临界流体提取法植物材料预处理：机械粉碎液氮研磨…….第二节细胞破碎

破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放目的影响细胞破碎的因素：1.细胞壁的结构2.破碎方法一、细胞壁的结构革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20~80nm）组成革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2~3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8~10nm可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎！霉菌的细胞壁较厚，约100~250nm酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎（一）机械法

1、匀浆法

2、珠磨法

3、超声波（三）化学法

1、化学试剂处理

2、酶解法

3、制成丙酮粉（二）物理法

1、干燥

2、冻融

3、渗透压冲击二、细胞破碎方法机械法高压匀浆法：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和

黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由

于研磨作用，使细胞破碎超声波破碎法：实验室常用。

影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等FrenchPress1.高压匀浆法

A.手轮；B.阀杆；C.阀体；D.阀座；E.撞击环高压匀浆器利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破碎。1.高压匀浆法

细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞、由高压（100~200MPa）到常压（0.1MPa）的变化，从而造成细胞破碎。高压匀浆器高压匀浆机型号：NS3015H

意大利GEANiroSoavi公司生产。

在1000bar的操作压力下破碎大肠杆菌，破碎率90％左右，2次以上的破碎次数可以获得更高的破碎率。在所有酵母菌破碎中均得到采用，如：酿酒酵母、啤酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母。

高压匀浆机2.高速珠磨法

工作原理：

将进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠一起搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎，释放出内含物。如图所示。高速珠磨机

在15-25kHz的频率下操作。原理与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。3.超声破碎法（Ultrasonication）一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波振荡器

（二）、物理法1.干燥法干燥使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性，同时部分菌体发生自溶。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。

方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥真空干燥多用于细菌。

2.冻融法将细胞放在低温（低于-15℃）下突然冷冻，而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。3.渗透压冲击法先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩；当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放至溶液中。（三）、化学法1.加入化学试剂（1）用碱处理（2）用脂溶性有机溶剂（3）表面活性剂碱处理：可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分，还可以调节溶液的pH，改变细胞所处的环境，从而改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。脂溶性有机溶剂：如丁醇、丙酮等，它们能溶解细胞膜上的脂类化合物，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来。表面活性剂：破坏细胞膜结构，引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。（三）、化学法2.酶解法利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的需与其它方法（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）配合使用。途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用;自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它

的酶导致自溶的方法：加热法、干燥法（三）、化学法3.制成丙酮粉制成丙酮粉：组织经丙酮脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎，使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。丙酮粉是微生物或生物组织，有时是蛋白质或酶的提取物，用丙酮脱水的干制品。制成丙酮粉是防止生物活性物质在水的存在下发生破坏变质的一种保存方法。三、细胞破碎率评价细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

Y(%)=[(N0-N)/N0]×100

N0－原始细胞数量

N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量目前N0和N主要通过下面的方法获得：直接计数法

在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数间接计数法

间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）四、细胞破碎方法综合比较五、选择破碎方法的依据处理量：规模及成本高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置目标物质的稳定性细胞的数量和细胞壁的强度破碎效果和产物释放率提取分离的难易

总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡第三节液-固分离固液分离将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物分离除去方法一、过滤二、离心一、过滤在推动力或者其他外力作用下悬浮液（或含固体颗粒发热气体）中的液体（或气体）透过介质，固体颗粒物质被过滤介质截留，从而使固体物质与液体（或气体）分离的操作。（一）过滤方式

1、常规过滤：料液流向与过滤介质垂直。

2、错流过滤：料液流向与过滤介质平行。常规过滤常规过滤包括：板框过滤、硅藻土过滤、石英砂过滤、滤芯过滤等。应用范围：植物提取、生物发酵、动物提取、酒水饮料等行业前置处理，实现固液分离。注意：间歇进行，必须周期性地清除膜表面的污染物层或更换膜错流过滤水流在膜表面产生两个分力，垂直于膜面的法向力，使水分子透过膜面，另一种是平行于膜面的切向力，把膜面的截留物冲刷掉。主要为膜分离技术，以压力为推动力，以半透膜作为过滤层。应用范围：植物提取、生物发酵、动物提取、中药提取、酒水饮料、制糖工业、食品添加剂等行业的物料澄清、纯化与浓缩。医药、化工、食品等行业纯水及超纯水的制备。错流过滤的优点过滤收率高由于过滤过程中，洗涤充分、合理，少量多次，故滤液稀释量不大的情况下，获得高达97～98％的收率滤液质量好凡体积大于膜孔的固体，包括菌体、培养基、杂蛋白等均不能通过膜进入滤液，大部分杂质被排除掉，给后续分离及最终产品质量均带来好处减少处理步骤鼓式真空过滤器一般需预涂助滤剂，板框过滤则需清洗、拆装，都费时费力，而错流过滤只需在18～20小时连续操作之后，用清水沿原管流洗4～6小时对染菌罐易于批处理，也容易扩大生产（二）过滤设备1、板框过滤机特点：过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）适用对象：广泛应用于培养基的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种微生物发酵液过滤板框过滤机2、真空鼓式过滤机鼓式过滤机是依靠液体自身的重力透过滤布，隔离杂物，从而达到净化液体目的。其优势是液池深度加大，滤布的利用率更高，占地空间少，运营成本更低。1.过滤介质：是指能使固－液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或膜过滤中所用的膜。如：滤布或膜过滤介质要求能耐酸碱、耐高温、耐化学试剂、抗拉性能好，有一定的机械强度和孔隙度（三）过滤介质和助滤剂微孔滤膜滤器内装微孔滤膜进液口出液口助滤剂要求为惰性物质、无毒、有一定细毒及硬度，成本低廉常用有助滤剂：硅藻土、珍珠岩、石棉、纤维素等2.助滤剂：工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂硅藻土一般是由统称为硅藻的单细胞藻类死亡以后的硅酸盐遗骸形成的，具有特殊的微孔结构，其本质是含水的非晶质SiO2，并含有少量Fe2O3、CaO、MgO、Al2O3及有机杂质珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，因其具有珍珠裂隙结构而得名，内部多孔空腔结构石棉是天然纤维状的硅质矿物的泛称，是一种被广泛应用于建材防火板的硅酸盐类矿物纤维，也是唯一的天然矿物纤维

使用惰性助滤剂助滤剂的作用主要是增加滤渣结构的疏松性，对杂质的机械截留助滤剂的使用方法有三种（1）预铺法：在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂（2）混合法：助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中（3）生成法：在反应过程中，产生大量无机盐沉淀物，使滤饼疏松，从而起到助滤作用二、离心分离1、过滤式离心机转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合二、离心分离2、沉降式离心机转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于