DNA芯片分析技术2003.3硕士班

第一部分 DNA芯片技术第二部分 蛋白质分析技术复旦大学上海医学院分子生物学实验室

高红gaohongyang2000@.cn1DNA芯片技术复旦大学上海医学院分子生物学实验室

高红gaohongyang2000@.cn2第一节 概述第二节 DNA芯片技术的操作流程第三节 DNA芯片技术的应用3第一节 概述4DNA芯片是信息时代的产物，横跨生命科学物理学计算机科学微电子学化学材料科学5DNA芯片是生物芯片（Biochip)的一种DNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片新型生物芯片6

在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面作为固相探针，待测的核酸片段人工标记上不同的荧光色素或同位素、生物素等作为靶片段，一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号，进行计算机分析，从而得到靶片段的基因序列、表达情况等信息。一.DNA芯片的原理DNAchip;Genechip;DNAarray;microarray;macroarray7DNA芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray/DNAchip8二.DNA芯片的特点

高度集成化大通量平行分析大规模高灵敏度样品需要量小9三.DNA芯片的主要类型原位合成芯片DNA微集阵列

ExpressionChipsGenomicChipsSequencingChips10四.DNA芯片总流程图

芯片的制作直接购买商品化芯片自行设计并向厂方定做购买芯片点样仪、玻璃片基或膜等；购买/合成OligoDNA或大规模PCR扩增目的片段；点样及固定；自制芯片

样品的制备待测样品核酸提取与纯化标记标记靶片段纯化杂交图像采集和分析反转录标记/PCR标记/随机引物标记等11第二节DNA芯片技术的操作流程12一.芯片的制作准备 点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布）

固定在芯片上的生物分子样品 固相支持物（即芯片片基） 制作芯片的仪器13点阵的设计基本方阵标记空白点对照看家基因对照探针基因每种2或4点141.固相支持物的种类及预处理实性材料：玻片、硅片、瓷片膜性材料：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜膜结合玻片原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸152.芯片制备方法原位合成 适用于：寡核苷酸原位光刻合成技术压电打印法

预合成后直接点样

适用于：大片段DNA、寡核苷酸、mRNA

针式打印喷墨打印16

原位光刻合成技术 美国Affymetrix公司专利

1718光敏保护基团；光刻掩膜（或蔽光膜）19原位光刻合成技术过程示意图20

每一循环需进行四步反应，若合成含n个核苷酸的寡核苷酸，则需 4×n个化学步骤 合成 4n个可能序列合成速度快、步骤少、探针数目呈指数增长；但每步产率较低，因此合成探针较短21压电打印法 类似彩色喷墨打印，但有多个芯片喷 印头及“墨盒”，“墨盒”中装四种碱基 合成试剂，喷印头在整个芯片上移动 其化学原理：固相合成DNA

40~50nt，产率较高22点样法设计点阵已克隆的基因片段；

PCR、RT/PCR等方法扩增的片段； 人工合成的DNA片段；带正电荷的尼龙膜或硅片、玻片等

23阵列点样机(arrayer)

针式打印（接触式）

喷墨打印（非接触式）紫外交联固定24Cartesian-PixSysSeries25

26SpotBotTM

个人化全自动芯片点样仪27点样仪检验指标点样精度点样速度点样密度样品的均一性样品是否有交叉污染（清洗）仪器操作的灵活性、简便性等等28二.待检测样品的制备

1.待检测样品中mRNA

或DNA的提取及纯化RNA的稳定性液氮或干冰;立即抽提RNA保护剂（注意适用范围）纯化2.RT、RT-PCR或PCR扩增（固相PCR系统）293.样品的标记伴随RTorPCR过程随机引物法、缺口平移法等标记物荧光染料，如Cy3、Cy5

生物素、地高辛放射性核素，如32P、33P

化学发光金属离子Au和Ag(纳米金属微粒探针)双/多色荧光标记标记产物纯化30

固相探针杂交结果观察，信息分析药物处理细胞总mRNACy5标记未处理的细胞总mRNACy3标记cDNA寡核苷酸31Cy3、Cy5双色荧光标记结果示意图32三.分子杂交芯片杂交盒、洗片器；芯片杂交仪杂交液清洗液影响杂交的因素

时间、温度、缓冲液等， 根据芯片上核酸片段的长短、用途选择 杂交条件33基因表达检测高盐、高样品浓度、低温、长时间（过夜），严谨性较低，有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度基因突变检测低盐、高温、短时间（几小时），严谨性高，有利于鉴别出单碱基错配34四.图像的采集和分析磷感屏成像系统荧光芯片扫描仪图像分析和数据处理软件

激光共聚焦成像系统

CCD摄像3532P标记33P段标记366400点的基因芯片（面积12X14mm)37Asuccessfulmicroarrayexperiment:Relativelylowbackgroundandhighanduniformsignalsinthisimageprovideabasisforcomparisonofthe

microarrays.Highbackground38Irregularspotmorphology

Comettails

39Streaks

Lowsignal

4041第三节DNA芯片技术的应用42一.巨大的应用前景

1.基因表达分析 2.基因组研究

作图、测序、基因鉴定、基因功能分析、SNPs

3.疾病的基因诊断 4.药物研究与开发

药物筛选、新药发现、合理用药、中草药、鉴定、 真假药鉴定

5.检测基因突变 6.其他领域431.基因表达分析原理 针对基因的保守区段设计多对完全匹配的寡核苷酸探针（PM）和与之相应的中心单碱基错配的寡核苷酸探针（MM），固定于芯片的相邻位置上，与标记的样品靶序列杂交。正常完全匹配的情况下（阳性），PM的杂交信号明显强于MM的杂交信号，而错配时（假阳性），两者的杂交信号区别不明显，（PM/MM）信号的比值可作为衡量阳性的指标。针对某一基因的三条以上探针呈阳性时，可定性的判定基因的表达。而通过比较正常和异常样品杂交信号的差异，来检测不同样品中基因表达水平的变化。44探针设计原则：1）探针序列应为特异性强和灵敏度高的寡核苷酸。2）(G+C)%应在40~60%。3）避免内部“发卡”结构(连续互补<4nt）。4）避免同一碱基的连续出现(<4nt)。5）探针与其他已知的各种基因序列进行同源性比较，若此探针序列与非靶基因序列有70%以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用。6）设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针来检测同一基因。452.基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同情况细胞的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性等进行综合评定与判断。463.疾病的基因诊断

目前诊断芯片主要涉及：癌症心血管疾病血液病遗传性疾病神经系统疾病部分感染性疾病免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等474.药物筛选

经过基因功能研究，可以确立与某些疾病相关的基因以及它们的表达情况。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组织在某些药物刺激下这些基因表达的变化情况，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选。485.检测基因突变原理

根据基因突变热点所有可能的突变情况设计多条寡核苷酸探针，合成、固定在芯片上的特定位置，与PCR扩增、标记的靶基因相应区段杂交，根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。49探针设计原则 以已知序列的突变热点位置为中心，按从左到右的顺序在目标序列中取一定长度的互补片段（<25bp)作为探针。对于这组探针，其中之一为野生型，而其他三种为突变型探针。将