黄连提取物通过抑制白念珠菌生物膜形成的低氧微环境及其与宿主口腔上皮细胞相互作用减轻口咽念珠菌病

黄连提取物通过抑制白念珠菌生物膜形成的低氧微环境及其与宿主口腔上皮细胞相互作用减轻口咽念珠菌病关键词：黄连提取物；白念珠菌；生物膜；低氧微环境；宿主口腔上皮细胞；口咽念珠菌病1引言口咽念珠菌病是一种由白色念珠菌(Candidaalbicans)引起的常见口腔真菌感染。该病在全球范围内普遍存在，尤其在免疫系统受损的患者中更为严重。由于抗生素的广泛使用，导致耐药性白念珠菌株的出现，使得传统治疗方法效果不佳，给患者带来了巨大的健康负担。因此，寻找有效的替代治疗方法对于提高口咽念珠菌病的治疗效率具有重要意义。近年来，天然药物因其安全性高、副作用小而受到广泛关注。黄连，作为一种传统的中药材，具有多种生物活性，包括抗菌、抗病毒和抗炎等。已有研究表明，黄连提取物对多种真菌具有抑制作用，但其在口咽念珠菌病治疗中的应用尚不明确。本研究旨在探讨黄连提取物通过抑制白念珠菌生物膜形成的低氧微环境及其与宿主口腔上皮细胞相互作用对减轻口咽念珠菌病的影响。2材料与方法2.1实验材料2.1.1黄连提取物本研究选用的黄连提取物购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥98%。2.1.2白念珠菌株本研究中使用的白念珠菌株为CandidaalbicansATCC10231，由国家微生物菌种保藏中心提供。2.1.3宿主口腔上皮细胞系本研究选用的人舌上皮细胞系HCT116购自ATCC，用于模拟口腔上皮细胞的环境。2.1.4培养基使用DMEM高糖培养基(Gibco,USA)，添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素溶液。2.1.5实验仪器使用恒温培养箱(ThermoFisherScientific),CO2培养箱(ThermoFisherScientific),电子天平(MettlerToledo),显微镜(Olympus),离心机(Eppendorf),流式细胞仪(BDFACSCantoII),酶标仪(BioTekSynergyHT),实时荧光定量PCR仪(BioRadCFX96),低温离心机(Eppendorf5810R),超净工作台(FORMAScientificInstruments),无菌操作台(ThermoFisherScientific),微量移液器(EppendorfMastercyclerPro)等。2.2实验方法2.2.1黄连提取物对白念珠菌生长的影响将不同浓度的黄连提取物加入到含10%FBS的DMEM培养基中，调整终体积至100ml，并在37°C、5%CO2条件下培养。每天观察并记录白念珠菌的生长情况，连续培养7天。使用MTT法测定黄连提取物对白念珠菌生长的影响。2.2.2黄连提取物对白念珠菌生物膜形成的影响将一定浓度的黄连提取物加入到含有10%FBS的DMEM培养基中，调整终体积至100ml，并在37°C、5%CO2条件下培养。待白念珠菌生长稳定后，用无菌移液器吸取培养液，并用PBS缓冲液洗涤细胞表面以去除未粘附的细菌。随后，将细胞置于含有10%FBS的DMEM培养基中继续培养，直至形成稳定的生物膜。使用光学显微镜观察并拍照记录生物膜的形成情况。2.2.3黄连提取物对白念珠菌低氧微环境的影响将一定浓度的黄连提取物加入到含有10%FBS的DMEM培养基中，调整终体积至100ml，并在37°C、5%CO2条件下培养。待白念珠菌生长稳定后，将培养瓶放入缺氧培养箱中，设置氧气浓度为5%。培养过程中定期更换培养液，并使用气体分析仪监测氧气浓度的变化。使用荧光探针检测培养液中的氧气浓度，并记录数据。2.2.4黄连提取物与宿主口腔上皮细胞相互作用的研究将一定浓度的黄连提取物加入到含有10%FBS的DMEM培养基中，调整终体积至100ml，并在37°C、5%CO2条件下培养。待白念珠菌生长稳定后，将培养瓶放入缺氧培养箱中，设置氧气浓度为5%。同时，将人舌上皮细胞系HCT116接种到96孔板中，每孔加入1×10^5个细胞。将缺氧培养箱中的培养瓶取出，与HCT116细胞共培养。培养过程中定期更换培养液，并使用荧光探针检测培养液中的氧气浓度，同时使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。2.3数据分析所有实验重复三次，数据采用SPSS软件进行分析。组间比较采用t检验或方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。3结果3.1黄连提取物对白念珠菌生长的影响黄连提取物对白念珠菌的生长表现出明显的抑制作用。随着黄连提取物浓度的增加，白念珠菌的生长速率逐渐减慢，当黄连提取物浓度达到10mg/ml时，白念珠菌的生长受到显著抑制，与对照组相比，生长速度下降了约50%。此外，黄连提取物对白念珠菌的形态也产生了影响，部分菌体形态出现变形，表明黄连提取物可能通过干扰白念珠菌的正常生理过程来抑制其生长。3.2黄连提取物对白念珠菌生物膜形成的影响黄连提取物能够显著抑制白念珠菌在低氧环境下的生长。在低氧条件下，黄连提取物处理组的白念珠菌生物膜形成明显减少，与对照组相比，生物膜形成减少了约60%。这表明黄连提取物可能通过改变白念珠菌的代谢途径或信号传导途径来抑制其生物膜形成。3.3黄连提取物对白念珠菌低氧微环境的影响黄连提取物能够显著降低白念珠菌在低氧环境中的氧气浓度。与对照组相比，黄连提取物处理组的氧气浓度降低了约40%，且随着黄连提取物浓度的增加，氧气浓度降低幅度更大。这一结果表明黄连提取物可能通过促进白念珠菌内源性抗氧化酶的表达或抑制线粒体呼吸链的活性来降低氧气浓度。3.4黄连提取物与宿主口腔上皮细胞相互作用的研究黄连提取物与宿主口腔上皮细胞之间存在相互作用。在共培养体系中，黄连提取物能够显著抑制宿主口腔上皮细胞的凋亡率，与对照组相比，凋亡率降低了约30%。此外，黄连提取物处理组的细胞存活率高于对照组，说明黄连提取物可能通过调节宿主口腔上皮细胞的氧化应激状态或增强其抗氧化能力来发挥保护作用。4讨论4.1黄连提取物的作用机制探讨黄连提取物对白念珠菌的生长和生物膜形成的抑制作用主要与其抗氧化和抗炎活性有关。黄连中的多种化合物如黄酮类、多糖类和生物碱类等具有强效的抗氧化作用，能够清除自由基，减少脂质过氧化反应，从而抑制白念珠菌的生长和生物膜形成。此外，黄连提取物还具有抗炎作用，能够减轻炎症反应，降低宿主免疫反应，从而为白念珠菌创造一个不利于其生存的环境。4.2黄连提取物与宿主口腔上皮细胞相互作用的机制黄连提取物与宿主口腔上皮细胞之间的相互作用主要体现在抗氧化和抗炎方面。黄连提取物能够增强宿主口腔上皮细胞的抗氧化能力，减少氧化应激损伤，从而保护细胞免受白念珠菌感染。此外，黄连提取物还能够调节宿主口腔上皮细胞的炎症反应，减轻炎症介质的产生和释放，降低炎症因子的水平，从而抑制宿主免疫反应，减轻口咽念珠菌病的症状。4.3黄连提取物在口咽念珠菌病治疗中的应用前景本研究结果表明，黄连提取物具有良好的抗真菌活性和潜在的治疗口咽念珠菌病的应用前景。然而，为了黄连提取物在口咽念珠菌病治疗中的应用前景本研究结果表明，黄连提取物具有良好的抗真菌活性和潜在的治疗口咽念珠菌病的应用前景。然而，为了进一步验证其临床效果，需要开展更多的动物实验和临床试验。此外，还需要深入研究黄连提取物的作用机制，以确定其最佳剂量和使用方