酒泉金塔甘草及其内生细菌对马钱子解毒作用比较

酒泉金塔甘草及其内生细菌对马钱子解毒作用比较摘要目的：比较酒泉、金塔甘草及其内生细菌对马钱子解毒作用的差异。方法：HepG2细胞接种于96孔板中，进行培养，药物分组为空白组、对照组、模型组、各甘草+马钱子组、各甘草内生细菌+马钱子组，模型组加入528ug/mL马钱子，各受试药物组加入110ug/mL甘草溶液或其内生细菌溶液，2h后再加入马钱子溶液培养，检测各组细胞存活率及CYP1A2、CYP3A4。结果：与模型组比较，酒泉、金塔甘草组及JQYB037、JQYB092、JTYB034组细胞CYP1A2、CYP3A4含量均升高（P<0.05或P<0.01）；与宿主组比较，酒泉、金塔甘草内生细菌组细胞CYP1A2、CYP3A4的含量均低于宿主组（P<0.05或P<0.01）；宿主组组间相比，酒泉甘草与金塔甘草组细胞CYP1A2、CYP3A4含量相近；内生细菌组组间相比，JQYB037、JQYB092组细胞CYP1A2含量高于JTYB034组，差异有统计学意义（P<0.05）；JQYB092组细胞CYP3A4含量与JTYB034相近，其余均低于JQYB092组。结论：在一定条件下，酒泉甘草内生细菌对马钱子毒性的缓解作用优于金塔甘草内生细菌。关键词：甘草；内生细菌；马钱子；解毒甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药等功效[1]，《本草纲目》载其“解百药毒”，由此可见解毒是甘草重要的功效之一。马钱子具有通络止痛，散结消肿等功效，但因为其自身的毒性而使临床应用一直受到限制。已有研究证实甘草与马钱子配伍可减轻马钱子毒性[2]。植物内生菌是指伴随原植物生长或某段时期生活在健康植物组织和器官内的微生物，研究证实，内生菌及其次生代谢产物可能具有与宿主植物相似的药理活性[3]。因此本实验通过研究甘草及其内生细菌对马钱子体外解毒作用的差异，为后续甘草及其内生细菌的解毒作用和质量评估提供实验依据。1.材料1.1细胞株HepG2细胞系购于中国上海生命科学院细胞保存中心。1.2药材及内生菌马钱子（Strychnos

nux-vomica

L.）购于甘肃中医药大学附属医院，甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）于2018年10月分别采集于甘肃省酒泉市和金塔县。上述两种药材经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定均为正品。甘草内生细菌菌株：基于本课题组前期体外抗菌实验筛选的51株内生细菌，其中29株对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，22株对肺炎链球菌有抑菌效果。1.3仪器名称厂家型号生物安全柜上海力申科学有限公司B2HFsafeCO2培养箱力康发展有限公司HF151高压灭菌器上海申安医疗器械厂LDZX-30FB酶标分析仪深圳雷杜生命科学股份有限公司RT-6100细胞计数仪美国荧光倒置显微镜CountstarIC-1000台式低速离心机长沙平凡仪器仪表有限公司TD4-II1.4试剂名称厂家型号胎牛血清美国HyClone公司SV30160.03高糖培养基美国HyClone公司SH30022.01高压灭菌器上海申安医疗器械厂LDZX-30FBPBS北京索莱宝科技有限公司409L021胰蛋白酶-EDTA消化液北京索莱宝科技有限公司20181016CYP1A2试剂盒上海恒远生物科技有限公司H19Y11CYP3A4试剂盒上海恒远生物科技有限公司H19Y112.方法2.1药物的制备甘草浸膏的制备：精密称取酒泉和金塔甘草粉末0.5g，将其置于50mL锥形瓶中，用10倍量75%乙醇，混合，浸泡30min，在50℃条件下，超声提取2次，30min/次，过滤，合并滤液，滤液用旋转蒸发仪真空浓缩至浸膏，放入4℃冰箱备用[4]。甘草溶液配制：精密称取各甘草浸膏粉末0.355g，置于100mL容量瓶中，加DMSO溶液425uL，待浸膏溶解完全，再加入50mL含血清的DMEM培养基，配成浓度为7.04mg.mL-1的甘草母液，置于4℃冰箱备用。马钱子浸膏的制备：精密称定马钱子粉末约0.6g，置于具塞锥形瓶中，加氢氧化钠试液3mL，混匀，放置30分钟后，加入三氯甲烷20mL，密塞并称重，置水浴锅中回流提取2小时，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，分取三氯甲烷液，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，蒸干成浸膏，置于4℃冰箱备用[5]。马钱子溶液配制：精密称取马钱子浸膏粉末0.1015g，置于100mL容量瓶中，加DMSO溶液0.5mL，待浸膏溶解完全，再加入4.5mL的含血清的DMEM培养基，配成浓度为20.3mg.mL-1的马钱子母液，置于4℃冰箱备用。内生细菌次生代谢产物的制备：挑取分离纯化的各甘草内生细菌的单个菌落，接种到普通营养肉汤培养液中，在37℃、220r.min-1恒温振荡器中，培养2d。收集发酵液，蒸干，置于4℃冰箱，备用。甘草内生细菌溶液配制：精密称取各甘草内生细菌浸膏粉末0.355g，置于100mL的容量瓶中，加DMSO溶液425uL，待浸膏溶解完全，再加入50mL的含血清的DMEM培养基，配成浓度为7.04mg.mL-1的甘草内生细菌母液，置于4℃冰箱备用。2.2细胞培养[6]将HepG2细胞从液氮罐中取出，37℃水浴锅加热，处理之后，做好标记，置于饱和湿度细胞培养箱中培养。2.3CCK8法检测不同剂量马钱子对HepG2细胞的增殖活力[7]取对数生长期的HepG2细胞，弃去旧培养基，PBS洗涤后，加入1mLEDTA消化液消化，调整细胞浓度为1×104个/mL。向96孔板中注入细胞悬液100uL，每组设置3个复孔，放入培养箱培养，待细胞贴壁。对照组加DMEM培养基10μL，模型组加入10μL马钱子提取物浓度为480、600、720、840、960μg/mL溶液，培养24h。弃掉旧培养基，用DMEM培养液洗涤。向每孔中加入100μL含10%CCK8试剂的完全培养液，在450nm波长下，用酶标仪检测吸光度。2.4CCK8法检测甘草及其内生细菌对马钱子诱导的HepG2细胞的增殖活力根据“2.3”的方法进行细胞培养、测定。分组及给药按照以下进行，对照组加DMEM培养基10μL，模型组加入10uL马钱子提取物，各甘草+马钱子组、各甘草内生菌+马钱子组先加入甘草及内生菌提取物10μL，预处理2h,再向每孔中加入与模型组相同剂量的马钱子提取物溶液，继续培养24h,进行细胞活性计算。2.5ELISA法检测HepG2细胞中CYP1A2、CYP3A4[8]根据“2.4”的方法进行细胞培养，分组及给药，采用ELISA法，按试剂盒方法检测HepG2细胞中CYP1A2、CYP3A4的含量。2.6数据处理采用SPSS19.0统计分析软件，各项指标均以±s表示，多组间采用单因素方差分析。以P<0.05为差别有统计学意义。3.结果3.1不同剂量马钱子对HepG2细胞增殖活力的影响随着加入马钱子溶液浓度的增加，HepG2细胞存活率降低，取半数抑制率IC50的马钱子溶液浓度（即528ug/mL）作为后续实验浓度，其最终结果如图1所示。图1：马钱子对HepG2细胞增殖的影响3.2抑制马钱子致HepG2细胞毒性有效菌株的筛选与空白组比较，模型组的细胞存活率显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，JQYB034、JQYB037、JQYB092、JQYB096、JTYB024、JTYB031、JTYB034、JTYB044菌株细胞存活率均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），其中酒泉甘草内生细菌4株，金塔甘草内生细菌4株，其余甘草内生细菌菌株细胞存活率均低于模型组。如表1所示。表1酒泉、金塔甘草内生细菌对马钱子的解毒作用菌株编号存活率（%）空白组100±0.01模型组50.25±0.15◆JQYB03467.85±0.70▽▽JQYB03759.52±0.52▽▽JQYB09264.64±1.09▽▽JQYB09662.23±0.34▽▽JTYB02464.72±3.04▽▽JTYB03159.33±0.53▽▽JTYB03455.95±1.93▽▽JTYB04462.25±3.88▽注：与空白组比较，◆P＜0.01；与模型组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.013.3酒泉、金塔甘草及内生细菌对HepG2细胞CYP1A2含量的影响与空白组比较，模型组细胞CYP1A2含量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，酒泉甘草、金塔甘草及JQYB037、JQYB092，JTYB034组细胞CYP1A2含量升高（P<0.05或P<0.01），JQYB096组细胞中CYP1A2含量升高，但差异无统计学意义。与酒泉、金塔甘草组比较，内生细菌组细胞CYP1A2含量低于宿主组（P<0.05或P<0.01）。甘草组组间相比，酒泉、金塔甘草组HepG2细胞CYP1A2的含量相近，差异无统计学意义。内生细菌组组间相比，JQYB037、JQYB092组细胞CYP1A2含量高于JTYB034组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果如表2所示。表2酒泉、金塔甘草及内生细菌对马钱子所致HepG2细胞CYP1A2的含量组别CYP1A2（pmol/L）空白组236.19±7.06模型组111.79±6.08*酒泉甘草组181.19±4.70◆金塔甘草组187.92±1.189◆JQYB034113.51±2.36#JQYB037142.62±3.27◆#□JQYB092142.80±3.81◆#□JQYB096125.59±27.89##JTYB01358.57±11.29▽JTYB024118.57±3.88▽JTYB034128.87±5.18◆◆▽JTYB044104.76±5.46▽注：与空白组比较，*P＜0.01。与模型组比较，◆P＜0.01，◆◆P＜0.05，与酒泉甘草组比较，#P＜0.01，##P＜0.05，与金塔甘草组比较，▽P＜0.01,与JTYB034内生细菌组相比，□P＜0.05。3.4酒泉、金塔甘草及内生细菌对HepG2细胞CYP3A4含量的影响与空白组比较，模型组CYP3A4含量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，酒泉甘草、金塔甘草组及JQYB092、JTYB034组细胞CYP3A4含量升高（P<0.05或P<0.01）。与酒泉、金塔甘草组比较，内生细菌组细胞CYP3A4含量低于宿主组（P<0.05或P<0.01）。甘草组组间相比，酒泉、金塔甘草组细胞CYP3A4的含量相近，差异无统计学意义。内生细菌组组间相比，JQYB092组细胞CYP3A4含量与JTYB034组相近，差异无统计学意义。表3酒泉、金塔甘草及其内生细菌对马钱子所致HepG2细胞CYP3A4的含量组别CYP3A4（ng/L）空白组316.81±8.021模型组153.73±9.26*酒泉甘草组252.65±28.92◆金塔甘草组279.38±16.696◆JQYB034116.30±13.89#JQYB03794.91±46.31#JQYB092217.89±33.39◆◆JQYB096191.16±33.39JTYB013140.36±16.041▽JTYB024132.34±48.443▽JTYB034222.17±16.976◆▽▽JTYB044118.97±12.252▽注：与空白组比较，*P＜0.01。与模型组比较，◆P＜0.01，◆◆P＜0.05，与酒泉甘草组比较，#P＜0.01，与金塔甘草组比较，▽P＜0.01，▽▽P＜0.05。4.讨论甘草素有“十方九草”的美誉，其应用广泛，能解诸毒。现代已有研究报道，甘草具有肾上腺皮质激素样作用，能够促进肝细胞中药物代谢酶P450的表达，加速毒物代谢，从而达到解毒目的[9]。毒性反应是在化学物质与生物系统的化学成分之间进行可逆或不可逆的相互作用，干扰机体正常\o"代谢"代谢及自稳机制，引起的\o"细胞死亡"细胞死亡、\o"细胞氧化"细胞氧化、\o"突变"突变、恶性变、\o"变态反应"变态反应或\o"炎症反应"炎症的反应，其主要是一个分子过程。药物进入机体后在Ⅰ相代谢酶的作用下发生氧化、还原反应等，使非极性脂溶性化合物变为极性水溶性较高而活性较低的代谢物。CYP450作为I相代谢主要的酶系，参与机体的反应。CYP1A2酶是人体的细胞色素P450酶系重要的亚族之一，大约占人体肝脏CYP酶总量的13%，其在肝脏CYP酶中含量排第三，还原态的吸收峰在450nm处，可将脂溶性有毒成分代谢成水溶性物质，使其排除体外，具有解毒作用[10]。CYP3A4和CYP1A2一样，也是细胞色素P450的重要亚族，主要分布在肝脏细胞中，约占肝脏中总CYP450的30%，是人体肝脏重要的酶之一，具有解毒作用[11]。HepG2肝癌细胞源于人体肝胚细胞瘤，与人体正常肝细胞来源相同，其分化程度较高，保留了完好的机体生物代谢I相酶，与正常人类原代肝细胞相比其体内的药物代谢酶不会随着传代次数的增多而降低，含有多种细胞色素P450酶[12,13,14,15]。因此本实验选用马钱子诱导人体肝癌细胞HepG2细胞来建立体外中毒模型。采用CCK8法检测不同剂量马钱子对HepG2细胞增值活力的影响，ELISA法测定HepG2细胞CYP1A2、CYP3A4的含量，以此来研究酒泉、金塔甘草及其内生细菌对马钱子解毒作用的差异。研究结果显示，与模型组比较，酒泉、金塔甘草组及其内生细菌JQYB037、JQYB092、JTYB034组细胞CYP1A2、CYP3A4含量均升高；与宿主比较，各内生细菌组CYP1A2、CYP3A4含量均低于宿主；宿主组间相比，酒泉、金塔甘草组CYP1A2、CYP3A4含量相近；有效菌株间相比，JQYB092组细胞CYP1A2含量高于JTYB034组，JQYB092组细胞CYP3A4含量与JTYB034相近。综上所述，甘草及其内生细菌具有缓解马钱子毒性的作用，且在一定条件下，酒泉甘草内生细菌的解毒作用较优。参考文献[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.一部[M].北京:

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