土壤中电子穿梭物质对异化铁还原的影响

土壤中电子穿梭物质对异化铁还原的影响

厌氧大米中的氧化铁还原是微生物诱导的还原过程，通过fe()作为最终电子受体进行厌

氧呼吸过程。水稻土中的Fe(IH)主要以各种氧化物形式存在，厌氧微生物对不同铁氧叱物

的利用能力有区别,其中比表面大的非晶体氧化物易于被利用，而针铁矿及赤铁矿等晶体结

构的氧化物因不易与微生物菌体外膜接触则难以被利用。当Lovley等提出电子穿梭体概

念后，人们对晶型氧化铁还原机理有了新的认识，即澈生物不需要直接和铁氧化物接触也能

进行铁还原过程。已有试验证据表明，能进行厌氧呼吸的细菌通常具有电子传递系统，从微

生物菌体外膜蛋白到Fe(IU)氧化物的电子传递可以通过中间体来完成，这一中间体被祢为

电子穿梭物质(ElectronShuttle),其可不断地从微生物的外膜蛋白接受电子，再把电子传

给Fe(W)复合物，完成对Fe(H)的还原。Fe(HI)还原微生物均具有还原腐殖物质或胞外醍

的能力。与Fe(W)络合的腐殖质可能是接受电子的基因,其中醍是接受电子的主要部分。

这些含醍基团被微生物还原成氢醍,而氢醍可被Fe(II)氧化再生成醍。通过这种方式,腐殖

质上少量的醍通过充当Fe(H)还原微生物和Fe(II)氧化物之间的电子穿梭体被反复利用，

从而促进Fe(III)氧化物的还原。

腐殖质是沉积物环境中含量丰富且稳定存在的一类复杂有机物，由于其结构复杂,实验室中

常用其同类物慈醍-2,6-二磺酸盐(anthraquione-2,6-disulfonale,AQDS)来研究腐殖质在

异化Fe(III)还原过程中的作用。有关研究发现,Fe(IH)还原微生物，如Geobacter

metallireducens和Shewanelaalgaju均可利用AQDS作为电子穿梭物质，在微生物与金属

氧化物之间高效地传递电子。因此,在实验室模拟研究中,AQDS常被用作促进Fe(IH)还原

的电子穿梭体。

以往的研究主要采用Fe(】I)还原微生物的纯培养试验,并且在许多铁还原菌的纯培养中均

发现了类似于电子穿梭体的物质，如c-型细胞色素、醍、腐殖酸、黑色素等均可自由穿梭

细胞内外,甚至携带电子穿梭于不同的微生物之间，促进铁的异化还原过程。然而,针对水

稻土中电子穿梭物质与氧化铁还原关系的研究鲜有报道。除无定形氧化铁外,土壤中？5%以

上的铁氧化物以晶体结构存在，其中包括纤铁矿、赤铁矿、针铁矿及其铝取代物。因此研

究电子穿梭体对水稻土中氧化铁的还原，无疑具有重要的理论和实际意义。本研究通过向

水稻土及来源于不同土壤的微生物混合培养中添加不同浓度AQDS,探讨水稻土中的微生物

对AQDS的功能响应,及其对土壤中异化铁还原过程的影响，为强化及调控水稻土中铁的异

化还原过程提供必要的理论依据。

1材料和方法

1.1土壤有机质含量

供试水稻土分别采自吉林市丰满区前二道乡(用JL表示)、四川省邛蛛市回龙镇(用SC表

示)、江西省安福县竹江乡(用JX表示)和浙江省宁海县梅林镇(用ZJ表示)。以上4种土

壤有机质含量分别为41.2,48,9,23.9和29.6mg/kg,无定型铁含量分别为

4.94,3.08,1.94和3.30g/kg,游离铁含量分别为10.01,11.69,6.48和11.9g/kg,pH分

别为4.85,7.34,4.84,6.ll(w(±):V(去离子水)=1:5)。土样自然风干，磨细,过孔径为1

mm的土壤筛，用以制备微生物接种液和进行土壤泥浆培养试验。

1.2微生物接种液

分别将风干过筛的四川和浙江水稻土以m(水稻土)：V(去离子水)=1:9的比例在30℃下淹水

1周。培养后的土样置于离心机中，700r/min离心10min,取上清液作为微生物接种液。

采用厌氧混合培养研究方法，以人工合成的Fc(011)3为惟一电子受体,采用来源于四川和浙

江的水稻土浸提液为微生物接种液。在若干10矶的血清瓶中分别加入1niL人工合成的

Fe(0H)3悬液(含铁量为054mg/mL),加盖，121℃高温灭菌30min。冷却后，分别加入过细

菌滤器《0.22um)后的氯化锈一磷酸盐混合溶液(含5ng/n)LNH4cl和25nlmol/LK21IP04-

KH2P04缓冲液)、葡萄糖溶液(50mg/mL),微生物接种液和不同浓度AQDS(0.1,0.5,4.0

mmol/L)各1mLo充氮除氧，密封，置于恒温培养箱中30℃暗光培养。

1.3不同浓度aqds溶液对血清的影响

称取采自不同地区的风干水稻土样品3.000g若干份，置于容积为10niL的血清瓶内，分别

添加不同浓度AQDS溶液(0.1,0.5,1.0,8.0mmol/L)3mL,以添加同体积无菌水处理作为对

照。充氮除氧，加盖密封。于30℃恒温培养箱中暗光培养。培养过程中定期采样测定

Fe(H)浓度。

1.4浸提液制备

每次采样时各处理取出1瓶,充分摇匀，剔除铝盖,揭开橡胶塞,用自动加样器吸取一定体积

悬液,每瓶取3次做重复。将取得的样品置于浓度为0.5mol/L盐酸溶液中，置培养箱口于

30℃下没提24ho浸提液过0.22um滤膜，用邻非啰咻分光光度法测定滤液中Fe(II)浓度。

2结果与分析

2.1添加aqsd对异构铁还原的影响

2.1.1还原作用机理：不同来源微生物对fe3的还原能力

分别以SC、ZJ水稻土浸提液作为微生物接种液，以微生物易于利用的Fe(011)3为惟一电子

受体，以葡萄糖为惟一电子供体，研究AQDS对异化铁还原过程的影响，结果见图1。由图1

可知，添加AQDS处理的Fe(0H)3还原速率较对照明显增加，口添加的AQDS浓度越大,AQDS

对Fe(OH),还原的促进作用越明显。证实了在体系中AQDS作为电子穿梭体起传递电子的作

用，加速了Fe(HI)的还原。

由图1还可以看出，SC水稻土中的微生物对Fe(0H)3的还原速率明显比ZJ水稻上的快，表

明不同来源的微生物对Fe(0H)3的还原能力具有一定的差别。此外,在反应过程中ZJ水稻

土的微生物对AQDS比较敏感，其Fe(II)浓度的增加速率较大。但各处理中无论异化铁还原

发生早或晚、速率快或慢,Ee(II)浓度均能达到一个稳定水平,而且Fe(II)浓度的稳定值与

初始体系中Fe(0H)3浓度954mg/mL)接近,说明在电子供体充足的情况下,Fe(OH)3的最

终还原量不受AQDS加入量的影响，即对于易还原的Fe(0H)3来说,AQDS的促进作用主要是

增加Fe(OH)3还原反应速率。

2.1.2对fe生成速率的影响

4种水稻土中添加不同浓度AQDS对异化铁还原过程的影响如图2所示。由图2可知,添加

AQDS不仅影响水稻土中Fe(III)的还原速率,而且对Fe(III)的最终还原量(用Fc(II)的生成

量表示)有显著的影响。同时,AQDS在不同土壤中的表现也存在一定差异。其中在JX、SC

和ZJ水稻土中，添加AQDS均能明显提高土壤中Fe(II)的生成速率,在培养10d内，Fc(II)

的生成量明显增大。在培养后期,Fc(II)的最终生成量也明显高丁•对照，表明AQDS对促进

土壤中部分晶体态氧化铁的生物还原具有重要作用。土壤中Fc(H)的生成量基本上随

AQDS浓度的增加而增大,仅在SC水稻土中高浓度(8.0mmol/L)AQDS处理较其他浓度AQDS

处理略有降低，但明显高于CK。添加不同浓度AQDS后不同水稻土对Fc(II)生成速率的敏

感性高低顺序为:SC>JX>ZJ.最终Fc(II)生成量的大小顺序为:JX>ZJ>SC。

在JL水稻土中，添加不同浓度AQDS后,其对Fe(II)的生成基本上均有抑制作用。在培养

10d内，Fe(II)的生成量及其速率小于或与CK接近，仅低浓度(0.1mmol/L)AQDS处理在

培养后期的Fe(II)生成最较CK略有增加。在整个培养期间高浓度(8.0mmol/L)AQDS处理

的Fe(II)生成量明显低于对照。这可能与土壤本身的有机质性质及土壤中铁还原微生物特

征有关。

2.2对不同aqds的响应

异化Fe(II)还原是微生物介导的生物学过程，与微生物的生长密切相关，所以可用表征微生

物生长动力学的Logistic方程描述。Logistic方程的表达式为:Y=a/[l+b•exp(-ex：]。

用Logistic方程拟合的Fe(IH)还原过程的参数见表1,2。利用参数a可得出Fe(HI)还原

的最大Fe(II)累积量;参数c表示还原速率常数;用参数a和c可求出最大反应速率Vniax,

其数值等于0.25ac;最大反应速率对应的时间TVmax,数值为lnb/c;r和s分别表示相关系

数和偏差。

由表1可知,在微生物混合培养试验中，Fe(OH)3还原速率常数⑹和最大反应速率(Vmax)均

随AQDS浓度的增加而增大。在ZJ水稻上中，0.1,0.5和4.0mmol/LAQDS处理的Ee(OH)3

还原速率常数(c)分别是对照的1.60,2.64及8.51倍，最大反应速率对应的时间(TVmax)较

CK分别提前了0.77,1.49和2.08d;在SC水稻土中,0.1,0.5和4.0mmol/LAQDS处理的

Fe(0H)3还原速率常数(c)分别是对照的1.56,2.28和2.41倍,最大反应速率对应的时间

(TVmax)较CK分别提前了0.29,0.35和0.93do对比2种来源微生物的Fe((0H)3还原过

程,ZJ水稻土对AQDS的响应较SC水稻土更为敏感。

由表2可见,AQDS对不同水稻土中Fe(01)还原的影响存在差异。在4种水稻土中，除JL水

稻土中8.0mmol/LAQDS处理外,其他AQDS处理表征Fe(H)还原潜势的最大Fe(ll)累积

量均较对照增加，增加比例分别为:JL104%〜】08乳JX107舟〜123%,SC102%-104%,ZJ

102%〜108%。随着AQDS浓度的增加，在JX和ZJ水稻土中的a值不断增大,其中在JX水稻

土中的增加幅度最大;JL和SC水稻土的a值逐渐减小。a值增大说明土壤中被还原的

Fe(IIl)量增力口,与CK相比增加的量主要是土壤中的晶体氧化铁。上述结果显示,AQDS对促

进土壤中晶体氧化铁的还原具有重要作用。AQDS对不同土壤中Fe(HI)还原速率常数⑹的

总体影响趋势表现为：随着AQDS浓度增大,Fe(III)还原速率常数(c)占CK的比例基本上降

低,其中JL水稻土为37%〜88览JX水稻土为158%〜203%,SC水稻土为115%-

282%(0.5mmol/LAQDS处理除外)，ZJ水稻土为146%〜2。8乳在SC水稻土中较低浓度的

AQDS处理对Fe(HI)还原速率常数⑹影响增大,如0.5nmol/LAQDS处理占CK的比例可达

379%,而在JL水稻土中AQDS处理的Fe(II)还原速率常数(c)均低于CK,8mmol/LAQDS处

理仅是CK的37%。这可能与土壤有机质性质及其含量有关。不同AQDS处理的V'max与

Fe(IH)还原速率常数(c)的变化趋势相似。当AQDS对Fe(IH)还原过程具有促进作用此均

表现为TVmax减小。

通常氧化铁还原与土壤的有机质含量有关。供试的JL、SC、JX和ZJ水稻土中有机质含量

分别为41.2,48.9,23.9和29.6mg/kg,与表2中铁还原最大累积量(a)比较可知,JX、ZJ

和JL水稻土中铁还原最大累积量(a)均随着有机质含量的增加而增大。但对SC水稻一.而

言，与JL水稻土相比尽管其有机质含量很高，但其铁还原最大累积量(a)却较低。这可能是

由I-SC水稻土属于石灰性十.壤,其有机质的性质及对土壤颗粒表面性状的影响与其他3种

土壤有所区别，大量存在改变了土壤颗粒表面有机质的分布与包裹状态，致使铁还原过程的

最大Fc(H)累积量降低。另外,本试验中发现,在有机质含量高的土壤(JL)中添加AQDS,随

着AQDS浓度的增加，最大Fc(【I)累积量有降低的趋势。这可能是土壤中原有的腐殖质充当

了铁还原电子穿梭体,添加AQDS反而抑制了微生物的活性。

在SC水稻土中,AQDS导致的Fe(II)还原速率常数(c)和最大反应速率(Vmax)的变幅最大，

这可能与不同浓度AQDS的pH变化有关。随着AQDS浓度的增加，其pH不断降低(图3；。异

化Fe(II)还原是微生物介导的酶促还原过程,微生物生长有其适宜的pH范围，酶促还原反

应也有最佳的pH值。因此，环境中的pH会直接影响异化Fe(I【)还原过程。SC水稻土是石

灰性土壤,过低pH必然会影响到土壤本身的微生物区系和活性,导致异化铁还原的Fetlll)

还原速率常数(c)和最大反应速率(Vmax)降低。

3添加aqds的浓度

腐殖质是沉积物和土壤中稳定存在的有机物聚积体。虽然腐殖质一直被认为对微生物引起

的异化还原作用无明显促进作用,但有研究指出，微生物在非溶性氧化铁还原条件下氧化有

机物质，可以通过添加腐殖质或醍族有机物来刺激该反应。腐殖质类物质在铁还原微生物、

铁氧化物及有机物之间可以非生物性的转移电子给Fe(III)氧化物，使Fe(III)还原为Fe(II)。

由于其所具有的这种电子穿梭性能,克服了铁还原菌和铁氧化物之间必须物理性接触的限

制条件,加速了铁还原。

本研究中，微生物混合培养和泥浆培养试验均表明,AQDS在Fe(lH)还原过程中作为电子穿

梭体起传递电子的作用，加速了Fe(HI)还原。关于添加AQDS的浓度范围，国外针对微生物

的纯培养研究较多。Lovley等报道，低浓度(50umol/L)的AQDS可促进铁氧化物与

P.islandiucn之间的电子传递,极大促进弱晶体铁氧化物的还原,且随着AQDS浓度(0〜

500Pmol/L)的增加，促进作用越明显,这同本研究混合培养试验的结果一致，即铁还原的速

率常数(c)、最大反应速率(Vmax)均随