人工细胞工厂设计构建 课件 第1-6章 绪论、代谢途径设计-人工大肠杆菌细胞工厂

绪论1.1人工细胞工厂1.2人工细胞工厂研发流程

1.3人工细胞工厂的应用领域1.4本教材的知识图谱绪论1.1

人工细胞工厂人工细胞工厂绪论1.1.1概念1.1.2类别1.1.3发展历程1.1.1概念绪论细胞工厂是指在细胞内，经过生物化学反应，将原料转化为产品的制造场所。人工细胞工厂是指通过理性设计和构建而获得的高生产性能的细胞工厂，能将无机碳或有机碳源转化为化学品、能源材料和医药等产品。人工细胞工厂1.1.2类别绪论按照生物类型

：人工微生物细胞工厂（人工大肠杆菌细胞工厂、人工芽孢杆菌细胞工厂、人工酿酒酵母细胞工厂、人工解脂酵母细胞工厂等）、人工植物细胞工厂、人工动物细胞工厂。按照细胞工厂的组成：人工单菌细胞工厂、人工混菌细胞工厂（为人工双菌细胞工厂、人工三菌细胞工厂、人工多菌细胞工厂等）。人工单菌细胞工厂是由一种微生物组成的人工细胞工厂。人工混菌细胞工厂由两种及以上微生物组成的人工细胞工厂，具有不同的遗传特性，可以是来源于同一个种的不同菌株，也可以是不同种甚至不同属级别以上的菌株。人工混菌细胞工厂的特点是以菌株之间的相互作用关系为基础，常应用于复杂原料利用、长途径和复杂结构产品的生产中。人工细胞工厂1.1.2类别绪论按照营养类型：人工自养型细胞工厂和人工异养型细胞工厂。按照产物分类：琥珀酸人工大肠杆菌细胞工厂、乙醇人工酿酒酵母细胞工厂、油脂人工解脂酵母细胞工厂等。为了与化石原料生产的产品区分开来，人工细胞工厂生产的产品通常被冠以“生物基”或“生物”的前缀，如生物基产品、生物基化学品，生物能源、生物燃料、生物材料等。这种分类的特点是既包括了产品，也指出了底盘细胞种类，在实际中最常用。从碳源利用角度分类：第一代人工细胞工厂主要是以淀粉、糖料、油料为原料，第二代人工细胞工厂是以纤维素、半纤维素等非粮用的生物质为发酵原料，第三代人工细胞工厂则是以二氧化碳等一碳为发酵原料。人工细胞工厂1.1.3发展历程绪论早期的细胞工厂是人类驯化野生微生物的结果，用于传统发酵食品、饮料等的生产。19-20世纪，应用物理化学的随机诱变技术，基于经验观察和定向筛选，集成有益性状，提升产能和生产效率，获得一批优良的微生物细胞工厂。特点是以葡萄糖为主要发酵碳源，主流是纯种培养，一种微生物细胞工厂对应一种产品，大吨位、液体发酵环境适应性强。20世纪后半叶，分子生物学、基因工程技术和原生质体融合技术的发展，形成了模式微生物细胞工厂。20世纪90年代创立了代谢工程，提高了产率，扩大了产品的生产范围及原料利用范围。21世纪初，合成生物学使细胞工厂升级到人工细胞工厂新阶段。该阶段的特点是人工细胞工厂的定制设计和精准构建，人工细胞工厂利用碳源及人工细胞工厂的动力呈现出多元化趋势。人工细胞工厂1.2

人工细胞工厂研发流程人工细胞工厂研发流程绪论1.2.1设计1.2.2构建1.2.3测试1.2.4学习人工细胞工厂研发流程绪论设计（Design）-构建（build）-测试（Test）-学习（Learn）（简称DBTL）循环是人工细胞工厂研发的基本模式，它是由生物系统执行四个层级任务决定的，即基因组携带所有遗传信息，通过转录将DNA信息转化为RNA分子，进而翻译成酶和蛋白质，在生物合成途径中催化生成目标产物。人工细胞工厂研发流程绪论1.2.1设计人工细胞工厂的设计包括产物代谢途径设计和底盘细胞设计两部分。产物代谢途径设计：通过生物计算机辅助设计软件，将内源代谢物与目标产物通过生化反应连接起来，提出候选催化酶，并将酶的氨基酸序列转化为基因元件的DNA序列，实现从目标产物分子的化学结构到代谢途径编码基因序列的转换设计。产物代谢途径设计的基本原则：途径简捷，代谢途径最短、反应步骤最少、每步反应转化效率最高、副产物最少，解除产物或中间代谢物对酶的反馈抑制，解除调控因子对代谢途径基因转录的阻遏抑制。人工细胞工厂研发流程绪论1.2.1设计底盘细胞设计：通过计量化学、计算机模拟等设计工具，使细胞生长、碳和氮代谢流平衡、前体和底物的供应充足、还原力和辅因子的再生与平衡，提出基础代谢和基因组改造的靶点和策略。在代谢途径设计中，还要确定可用于工业化生产的原料，解除目标产物对底盘细胞的毒性。一般选择廉价易得、供应充足的大宗原料，兼顾下游分离纯化工艺，进行产品的高效生产人工细胞工厂的定制设计。人工细胞工厂研发流程绪论1.2.2构建人工细胞工厂构建：指使用合成生物学工具，将设计信息转化为实体细胞工厂，包括代谢途径的构建和底盘细胞改造。代谢途径构建的基本过程：合理选择启动子和终止子等生物元件，确定代谢途径基因的表达模式；通过连接酶和组装工具酶将代谢途径编码基因与启动子和终止子串联，形成表达盒和转录单元。启动子和终止子元件大多来源于底盘细胞及其衍生的文库；代谢途径基因元件可基于密码子优化的设计序列，通过化学合成制备。染色体整合表达比游离质粒表达代谢途径更稳定，有利于人工细胞工厂的工业生产。底盘细胞改造：敲除竞争性途径基因和阻遏基因、弱化干扰途径基因。强化前体供应或底物利用途径基因的表达，也是常用的改造策略。人工细胞工厂研发流程绪论1.2.3测试人工细胞工厂测试：指采用生理生化和组学技术，对人工细胞工厂性能进行全面检测和分析，为检验构建是否成功及设计的真实效果提供数据。测试项目包括：代谢物合成和积累，包括中间代谢物、副产物、目标产物及其产量等；代谢途径表达，包括反转录PCR检测代谢途径基因转录、蛋白质电泳检测酶的表达

丰度等；生长状态和生理指标，包括生物量、细胞形态、耗糖、pH变化等；组学检测，测试基因组、转录组、蛋白质组和代谢组，获得跨组学大数据。人工细胞工厂研发流程绪论1.2.4学习人工细胞工厂学习：收集人工细胞工厂的测试数据，进行计算和模拟分析，为本轮设计-构建-测试的效果做出决定和指导意见。将测试的量化数据传输到学习平台，由机器学习进行全面统计分析和集成，确定显著影响人工细胞工厂性能的设计因素，如所选择的启动子、质粒拷贝数、代谢途径基因、调控回路、底盘细胞靶点等的贡献程度和效果。寻找基因-转录-蛋白-代谢物的层级关联，建立和优化模型，将人工细胞工厂的表型与基因型对应起来。从所有的设计-构建-测试过程中学习和训练，提出新设计规则，拓展生物设计空间。利用预测对模型进行修正，指导下一轮人工细胞工厂的迭代设计和构建。通常以本轮最佳组合的人工细胞工厂为起始，进行下一轮的设计-构建-测试-学习循环。1.3

人工细胞工厂的应用领域人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.1化工领域1.3.2能源领域1.3.3材料领域1.3.4农业食品领域1.3.5医药领域人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.1化工领域合成生物基化学品：人工细胞工厂可替代化石原料，使用生物质原料，如淀粉、葡萄糖、纤维素、木质素、地沟油和废蛋白等生产生物基产品，能减少温室气体排放，是一种有潜力的低碳、零碳可持续绿色生产制造技术。光合微生物细胞工厂，利用二氧化碳生产生物基化学品，可达到负碳生产制造的目标。合成大宗化学品：通过设计和构建人工微生物细胞工厂，已经实现了从二碳酸和二碳醇到六碳酸和六碳醇主要大宗化学品的合成，其中乙酸、丙二醇、琥珀酸、戊二胺、己二酸等已经实现了规模化生产和产业化应用。合成芳烃、芳醇、芳酸产品：在对莽草酸途径和芳香氨基酸途径改造的基础上，设计和构建芳环化学品合成途径，合成苯酚、苯乙烯、苯丙烯等芳烃、芳醇、芳酸产品。人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.2能源领域合成短链生物燃料：人工细胞工厂合成短链有机醇，如乙醇、丁醇、异丁醇、异戊醇、3-甲基-1-丁醇等。人工酿酒酵母细胞工厂生产的第一代生物乙醇，作为石油基燃料的替代品，添加到汽油中，在全球范围内已经用于燃油车中。合成长链生物燃料：对脂肪酸途径进行设计和改造，人工微生物细胞工厂已经合成了偶数碳和奇数碳的长链烷烃及脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯。人工微藻细胞工厂可合成碳链超长的28-30碳脂肪酸、生物柴油，续航能力强，适合于远洋轮船使用。合成航空燃料单体：对萜类途径进行设计和微生物底盘改造，人工细胞工厂已经合成了燃料分子单体，如柠檬烯，蒎烯、石竹烯、法尼烯、没药烷，等。从纤维素和半纤维素到燃料分子的合成微生物技术路线已经打通，优势是不与人争粮、不与粮争地、环境友好，原料产能大、供应充足。人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.3材料领域合成可降解塑料：人工微生物细胞工厂直接合成聚乳酸、聚3–羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等聚酯，已经产业化应用。人工细胞工厂生产的生物基单体二元酸和二元醇，可用于合成聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二酸丁二醇酯、聚丁二酸丙二醇酯、聚己二酸丙二醇酯等聚酯塑料。合成聚氨基酸材料：人工微生物细胞工厂能直接利用糖，发酵生产聚谷氨酸、聚赖氨酸等等聚氨基酸材料。合成生物基橡胶：人工细胞工厂可以直接生产生物基聚异戊橡胶的单体，包括异戊二烯、月桂烯、法尼烯等，生物基聚异戊橡胶的性能更接近天然生物橡胶。合成生物蛋白材料：在微生物中表达蛋白材料的结构单元基因，已经合成了胶原蛋白、贻贝蛋白、蛛丝蛋白、蚕丝蛋白等，其中胶原蛋白已经实现了产业化应用。人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.4农业食品领域合成食品原料和添加剂：传统大品种氨基酸、有机酸、维生素等人工细胞工厂，经过设计和重构后，提升生产性能和转化率。人工细胞工厂的应用扩大了小品种氨基酸、有机酸、维生素、营养素等生产的种类和品种。合成肉和合成牛奶：采用组织工程策略，动物胚胎干细胞或肌肉组织细胞工厂，可直接生产出肌纤维和大块组织等养殖肉。人工微生物细胞工厂生产乳清蛋白、酪蛋白、脂质等组分，可用于配方生产合成牛奶。设计构建混菌细胞工厂，调控不同菌群的种类和比例，可改良食品酱油、醋、酒等工艺，还可改善风味和提高品质。人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.4农业食品领域合成植物活性成分：具有营养生理和调节功能的部分常见活性成分都已经能用人工微生物细胞工厂合成，其中番茄红素等产品已获得许可使用。萜类：香叶醇、柠檬烯、β-胡萝卜素、番茄红素、人参皂苷等黄酮：白藜芦醇、姜黄素、甘草苷、大豆苷元、槲皮素、根皮苷、水飞蓟宾等人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.5医药领域人工细胞工厂可用于生产化学药物和生物制品。主要化学药物包括抗生素和植物源药物。生产抗生素：通过途径设计和基因组改造构建，强化和提高人工放线菌细胞工厂、人工霉菌细胞工厂的抗生素生产性能。合成植物源药物：人工大肠杆菌细胞工厂、人工酿酒酵母细胞工厂、人工汉逊酵母细胞工厂、人工毕赤酵母细胞工厂等是合成植物源药物的主流微生物细胞工厂，已经合成了萜类、生物碱、黄酮类等众多的结构复杂、难以化学合成的植物源药物或药物前体，具有广阔应用前景。萜类药物：紫杉二烯、青蒿酸、大麻素、氢化可的松、人参皂苷Rh2、冰片，等生物碱药物：吗啡、咖啡因、长春碱、小檗碱，等。黄酮药物：葛根素、灯盏花素，等。人工细胞工厂的应用领域绪论1.3.5医药领域生物制品包括重组蛋白质药物、抗体、细胞药物、疫苗、活生物药物。生产重组蛋白质药物：胰岛素、干扰素、促红素，等生产疫苗：新冠疫苗，乙肝疫苗，等。生产抗体：阿达木单抗、帕博利珠单抗、乌司奴单抗等。生产细胞药物：CAR-T细胞，类胰岛定制化细胞。活生物药物：设计和构建混合益生菌细胞工厂，维持肠道正常结构及生理功能，可抵抗病原菌感染和治疗相关疾病。如，治疗苯丙酮尿症。本教材的知识图谱绪论1.4本教材的知识图谱本章小结绪论谢谢！代谢途径设计2.1概述2.2基于约束的代谢途径设计

2.3基于图论的代谢途径设计2.4逆生物合成代谢途径设计2.5代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计2.1概述概述代谢途径设计2.1.1代谢途径设计的基本流程2.1.2代谢途径设计依赖的数据库代谢途径设计的基本流程概述代谢途径设计基本流程代谢途径设计依赖的数据库概述各种数据库提供了丰富的生化数据和信息资源酶与反应信息数据库代谢网络模型数据库生化反应与代谢数据库化合物数据库BRENDA、UniProt、ATLAS、ATLASx、ENZYME、eQuilibrator、dGPredictor、GotEnzymes、SABIO-RK、ExplorEnzBiGG、ModelSEED、BioModels、HumanMetabolicAtlas(HMA)KEGG、MetaCyc、Rhea、Reactome、BioCyc、MetaNetX、MetRxn、BKM-reactPubChem、ChEBI、CASCommonChemistry、CAMEOChemicals、HMDB、RxnFinder2.2基于约束的代谢途径设计基于约束的代谢途径设计代谢途径设计2.2.1基于约束的代谢途径设计原理2.2.2基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计原理基于约束的代谢途径设计原理：将代谢网络表示为化学计量矩阵，基于代谢网络的计量学平衡，通过使用线性

规划的方式搜索解空间，计算满足特定约束条件下的物质、能量、还原力平衡

的最优代谢途径。方法：通量平衡分析(fluxbalanceanalysis，FBA)

以代谢网络计量矩阵和反应通量上下限作为约束，以生长或产物生成速率为优化目标，搜索满足物质、能量、还原力平衡的最优代谢途径。

基于约束的代谢途径设计原理基于约束的代谢途径设计FBA算法的组成基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的途径设计和基于数据库的途径设计名称数据库/底盘途径筛选原则基于底盘的途径设计MapMaker/PathTracer底盘途径长度，元素转移OptMDFpathway底盘热力学，产物得率ECM底盘热力学，酶动力学CAVE底盘产物得率，途径长度OptStrain底盘、KEGG，产物得率，非天然反应数量，生长速率基于数据库的途径设计optStoicMetRxn途径长度，热力学，总代谢通量，化学计量BNICEKEGG、ATLAS途径长度，热力学，SimphenyBIGG途径长度，热力学，产物得率，已知代谢物/酶数量CFPBIGG途径长度comb-FBAMetaCyc、ATLAS产物得率，途径长度基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的内源产品途径设计确定目标产品基因组尺度网络模型的选择途径的模拟设计与分析基于大肠杆菌基因组尺度网络模型iJO1366模拟设计P3HB最优代谢途径基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的内源产品途径设计在线设计工具——CAVE整合质控途径设计途径可视化基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于特定底盘的异源产品途径设计确定目标产品基因组尺度网络模型的选择计算结果分析及可视化在线设计工具——WPHP底物和目标产品的输入查询输入模块计算结果总结计算途径总结途径的可视化基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计

基于数据库的代谢途径设计是从包含多物种反应的数据库中搜索产品的代谢途径，搜索空间更大，更容易获得产品的新代谢途径。主要设计原则是通过元素平衡、电荷平衡、热力学可行性等约束识别最佳的整体化学计量，通过网络化学计量、反应方向性、交换反应通量等约束最小化反应数目或总代谢通量，以满足第一步得到的最佳的整体化学计量。基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计工具设计工具数据库途径筛选原则optStoicMetRxn途径长度，热力学，总代谢通量，化学计量BNICEKEGG、ATLAS途径长度，热力学，SimphenyBIGG途径长度，热力学，产物得率，已知代谢物/酶数量CFPBIGG途径长度comb-FBAMetaCyc、ATLAS产物得率，途径长度PathPredKEGG、RPAIR途径长度，化合物相似性novoPathFinderKEGG、ChEBI、BIGG、Rhea途径长度，热力学，产物得率SimIndex/SimZymeModelSEED、BRENDA化合物相似性，途径长度基于约束的代谢途径设计方法基于约束的代谢途径设计基于数据库的代谢途径设计基于不同方法的甲醇同化途径预测结果新的乙醛酸同化途径（glycolaldehydeassimilation,GAA）途径2.3基于图论的代谢途径设计基于图论的代谢途径设计代谢途径设计2.3.1基于图论方法进行代谢途径设计的原理2.3.2基于图论的代谢途径设计方法基于图论的代谢途径设计基于图论方法进行途径设计的原理基于图论的拓扑学方法进行代谢途径的设计，通过将代谢网络表示为图，节点和边表示代谢物或反应，利用相关算法预测底物到产物的所有可行途径。优势：便于对代谢网络的全局结构特征进行分析更快地搜索两个代谢物间转化的最短途径计算量显著降低基于图论的代谢途径设计基于图论的代谢途径设计的方法设计工具数据库搜索算法网络表示方法流通代谢物处理方式途径排序原则FMMKEGGBreadth-firstsearch复合图移除途径图数量-KEGGDFS二分图代谢网络加权途径权值PHTKEGGBFSwithHOHL复合图结构相似性结构相似度与途径长度ReTraceKEGGHeuristicsearch二分图原子映射原子守恒和途径长度-KEGGJimenez'sk-shortestpaths二分图组合方法Wilcoxon配对符号秩检验与途径长度PATHcre8KEGGYen'slooplessk-shortestpathwithA*heuristic二分图移除热力学，化合物毒性，产物消耗，酶拷贝数LPATKEGGBPAT-M二分图组合方法原子守恒和途径长度MREKEGGYen'slooplessk-shortestpath复合图组合方法热力学和宿主的基因AGPathFinderKEGGCAGTG复合图组合方法反应热力学和化合物相似性BPFinderKEGGBPFinder复合图组合方法化合物相似性，热力学可行性和保守原子团基于图论的代谢途径设计依据对流动代谢物的处理方式不同，分为5类：1.流通代谢物移除2.代谢网络加权3.代谢物结构相似性4.原子映射5.组合方法基于图论的代谢途径设计的方法基于图论的代谢途径设计的方法流通代谢物移除流通代谢物最常用的处理方法是直接从网络中去除，但该方法导致流通代谢物作为主代谢物参与的途径也一并被去除。因此，流通代谢物不能被简单地定义并从网络中排除，而是由其在具体反应中的功能决定的。流通代谢物可按照在反应中的功能成对去除，如用于转移氨基的α-酮戊二酸和谷氨酸代谢物对，转氢的NADH和NAD代谢物对，以及转移磷酸基团的ATP和ADP代谢物对。这些代谢物对在反应中的功能只是将一些基团转移而并不参与反应中主代谢物的碳骨架转化，因此可以被成对去除。基于图论的代谢途径设计的方法流通代谢物移除PATHcre8工具，可根据KEGG数据库中代谢物参与反应的数目筛选出43个流通代谢物，之后再将代谢网络转化为代谢物图时直接去除这些流通代谢物以减少无意义的连接。虽然通过这种方式可以一定程度上减少无生物学意义途径的产生，但是该方法还存在无法识别主次代谢物的局限PATHcre8预测的苯丙氨酸合成白藜芦醇的最优途径基于图论的代谢途径设计代谢网络加权为了避免预先定义流通代谢物，可用代谢网络的加权进行处理。将代谢网络表示为一个加权图，对每个代谢物分配一个权重参数，其值为代谢物在网络中参与的反应数目。通过搜索算法，找到权重最小的一条或多条途径。目前报道了两套用于比较的数据集，一套为KEGG数据库和aMAZE中的已知56条途径，另一套为EcoCyc数据库和大肠杆菌中的已知92条途径。利用这两套数据集和搜索算法，与原网络和移除流通代谢物的网络比较，加权网络的途径设计准确性最高。但加权代谢网络设计的局限性是流通代谢物仍会出现在部分途径中，有些中心代谢物（如丙酮酸）也会被分配较高权重。因此，加权代谢网络设计只能部分解决流通代谢物的问题。基于图论的代谢途径设计借助代谢物结构信息的策略，也可避免预先定义流通代谢物。如PHT（pathwayhuntertool，PTH），使用来自CDK（chemistrydevelopmentkit，CDK）的指纹算法，将二维的化学结构信息转换为一维的二进制流，通过指纹进行快速的代谢物结构相似性搜索。同时，通过代谢物的原子量和Tanimoto算法得到归一化评分函数，计算两个分子之间的相似性，从而避免途径中假阳性连接，使设计结果更具生物学意义。由于不是所有代谢物都有结构信息，因此该方法设计会丢失部分合成途径，但整体设计结果的准确性比流通代谢物移除、加权代谢网络有很大的提升。代谢物结构相似性基于图论的代谢途径设计依据代谢物的结构信息，基于KEGG数据库反应数据，搭建了反应物对数据库RPAIR，用于描述底物到产物之间的原子转移。使用分子对齐的化学结构比较方法，提取得到9125个反应物对信息，并将其分为5种类型，分别描述底物、氧化还原酶辅因子、转移酶的转移基团、连接酶的三磷酸核苷、分解酶和水解酶等酶的无机化合物的变化。根据此数据库，开发途径设计方法就能在很大程度上避免无生物学意义的连接。代谢物结构相似性基于图论的代谢途径设计ReTrace是第一个利用原子映射信息查找分支途径的工具，该工具基于Arita的ARM方法原则，即认为一个有生物学意义的途径应该至少将一个原子从底物转移到产物中。ReTrace在Arita方法基础上进行了改进，通过确保底物到产物之间原子转移数量最大，来发现两者之间的最短合成途径，并将这些最短途径进行组合以发现分支途径和高得分途径。原子映射原子映射示例基于图论的代谢途径设计相较于单一的处理方法，组合方法在途径设计中更受欢迎且效果更佳。Faust等在Croes的代谢网络加权方法基础上进行了改进，通过结合加权网络和RPAIR数据库中包含的KEGG反应中反应对的注释，实现了更为精准的预测：MRE方法通过加权的方式构建宿主依赖的代谢网络，并将此概率的对数值作为权重赋予到代谢物图的边上，从而在进行途径设计时可以区分内源和外源反应。AGPathFinder方法，通过原子团的映射数据进行途径搜索，并引入反应热力学信息和代谢物结构信息作为约束，使得计算所得途径更具生物学意义。Tervo等尝试将图论方法与约束方法结合，提出了MapMaker和PathTracer方法。其中MapMaker用于确定碳转移，方便结果分析；PathTracer用于途径设计，可以找到两个代谢物间最短最可行的途径。组合方法2.4逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计代谢途径设计2.4.1逆生物合成代谢途径设计的原理2.4.2逆生物合成代谢途径设计的方法逆生物合成代谢途径设计的原理逆生物合成代谢途径设计原理：逆合成代谢途径设计是从目标分子结构出发，采用逆合成算法，设计目标化合物的代谢途径。逆合成算法的核心是利用计算机分析官能团转换、键的切断或酶的作用，将目标化合物转变为简单的化合物，使其与微生物细胞的代谢物、前体相匹配，直到基础化合物（如葡萄糖等）。主要分为途径的预测和途径的筛选两个模块。其核心是利用计算机分析如何“换团”或“断键”并将目标化合物分解成更简单的化合物，将分解的化合物与微生物体内化合物相匹配。逆生物合成代谢途径设计的方法按照不同寻找前体化合物的方法可分为两类：在数据库中检索，这种方法利用已知代谢反应预测反应寻找前体化合物，使用这种方法的工具有DESHARKY和Metabolictinker等；基于反应规则来寻找前体化合物，这种方法可以产生新化合物，预测新反应，如RetroPath、RetroPath2.0和RetroPathRL等。逆生物合成代谢途径设计

生物合成途径相由多个单步反应的组合而成，因此其预测关键在于对某一特定化合物的单步生物合成反应的预测。对于单步生物合成反应的预测，一般认为酶可以催化与底物具有相似化学结构的化合物，因此可借鉴已报道生化反应的转化模式及相应的酶序列来预测与底物具有相似结构化合物发生的新生化反应。

逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法在反应数据库中检索与前体化合物相关的反应，提取反应规则。识别目标分子，确定目标分子的类型，是烷烃、单官能团化合物，还是多官能团化合物等。对目标分子进行逆向剖析，根据目标分子的结构特点，对其进行官能团转换或碳架改造。利用提取的反应规则进行反应预测。逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法工具反应规则来源反应规则数PathPredKEGGRPAIR1979ReversePathwayEngineering(THERESA)BioPath3516RetroPathMetaCyc3000(d=4)5000(d=14)BNICEKEGG，ATLAS722RetroPath2.0MetaNetX6900(d=2)19000(d=16)PrecursorFinder依靠反应检索280000RetSynthMetaCyc-RetroPathRLRetroRules146000常见逆生物合成代谢途径设计方法逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法利用RetroPath2.0实现对目标分子的代谢途径设计需要的输入有三个，分别是Source、Rules、Sink：Source是RetroPath2.0所针对的要被反应规则作用的化合物，即将用作预测反应起点的化合物。在逆合成代谢途径设计中，Source是目标化合物，途径的终点。Rules即反应规则，描述了底物向产物转化时，相关反应的键合模式的变化，模拟了代谢途径中各个酶的作用，因此其应尽可能对系统中可能发生的所有反应进行编码。在逆合成代谢途径设计中，Rules将不断作用于目标化合物与中间代谢物，寻找前体化合物，直至寻找到起始化合物。Sink是系统中事先给定的起始化合物集合，即途径的起点，当逆合成算法寻找到Sink中的代谢物时会停止搜索。在逆合成代谢途径设计中，Sink为代谢途径起点的所有化合物的列表。逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法苯乙烯合成途径对苯二甲酸合成途径逆生物合成代谢途径设计逆生物合成代谢途径设计的方法2.5代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径设计（1）化学计量可行性

（5）代谢物毒性（2）热力学可行性

（6）途径长度（3）动力学可行性

（7）酶的可用性（4）目标产品的理论得率（1）化学计量可行性

为了评估化学计量学可行性，每条预测途径都被引入到底盘基因组尺度代谢网络模型中，通过通量平衡分析对目标化合物的合成进行优化计算，用于确定在宿主生物体中可用的共底物或辅因子的途径，也用于排除在宿主体内由于产生不可再利用的副产物等导致的不可行途径。此外，在该过程中还可以计算出底物的理论碳得率，其可作为排序标准。总体化学计量转换(如aA+cC<=>bB+dD)可以抽象出包括代谢物、离子和自由能在内的化学变化的整体元素平衡表。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（2）热力学可行性

为了评估热力学可行性，需要收集或计算代谢途径中反应的热力学数据。吉布斯自由能变化ΔG表示反应的热力学势能变化，决定了酶促反应的方向性和效率，是检测和选择预测途径热力学可行性及评估生物合成途径热力学驱动力的重要手段。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（3）动力学可行性

为了评估途径的动力学可行性，需要建立所设计途径的动力学模型，包括：定义代谢网络，定义运动速率表达式，分配参数值，根据测量值或报告数据定义代谢产物和酶水平的初始浓度，用完整的动力学模型进行仿真并计算通过途径的通量。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（4）目标产品的理论得率

大部分代谢产物，如核苷酸、芳香族氨基酸等，由于其合成途径复杂，涉及副产物及多个前体，很难通过简单观察或手工计算得到其理论得率。此外，在产品合成过程中还涉及能量（如ATP）和还原力的产生和消耗，需要额外消耗底物产生能量和还原力，或通过某种途径消耗掉多余的能量还原力，这使得产物得率的计算更为复杂。因此需要通过构建底盘宿主内源化合物及相关反应对应的化学计量矩阵来建立基因组规模代谢网络模型，并利用FBA算法计算途径在目标底盘宿主中化合物的理论得率，且常以得率最大化为优化目标来选择途径。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（5）代谢物毒性

有毒副产物或途径中间体的产生可能对宿主有害，将妨碍途径中酶在底盘宿主中的正常表达，并严重降低目标产品的产量。为了避免在工程细胞中积累有毒化合物，应考虑两个因素：有毒代谢物的浓度和化合物的毒性程度。通常采用化合物的半数抑制浓度（thehalfinhibitoryconcentration，IC50）作为化合物毒性的评价指标，表示一半细胞种群的生长受到抑制时的化合物浓度代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（6）途径长度

最常用的途径排序方法是根据反应步数，因为这可以很容易地转化为许多方法的目标函数，以找到总通量最小的最短途径。最短途径也意味着反应步骤最少或酶需求最小，从而减少宿主细胞的代谢或遗传负担。

目前一些算法如optStoic、CFP等结合途径长度对预测途径进行打分和排序，而逆合成预测工具通常采用混合整型线性规划方法模拟设计，筛选底物到目标产物的最短途径。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价（7）酶的可用性

基于约束方法、图论或者逆合成设计的代谢途径，有无催化目标反应的酶序列对于预测途径的实现十分重要，如果没有催化相应生物转化的酶，则通常需要为底物寻找一种天然混杂酶，甚至需要设计全新的催化酶，但结果存在很大不确定性。因此，当利用基于规则的途径设计方法时，通常会根据已知酶的数量对途径进行排序。

在延伸预测途径时可能一些反应规则不存在相关联的酶序列，此时预测出的新反应需要依靠人工查询文献以寻找酶序列，这将降低设计的效率，因此在选择反应规则时应当增加与酶序列相关联的反应规则的权重，提高酶催化反应的可行性。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价综合评价

在实际情况中，常使用不同指标的加权组合来对途径进行综合评价，不同方法的联用可以互相弥补不足，同时又发挥自身的优点，以提高预测的准确性，使得预测结果更加全面、合理。代谢途径设计代谢途径筛选原则与综合评价代谢途径构建3.1游离表达设计与构建3.2染色体整合表达设计与构建3.3调控回路设计与构建代谢途径构建3.1游离表达设计与构建游离表达设计与构建代谢途径构建3.1.1串联表达3.1.2融合表达3.1.3酶复合体表达3.1.4模块表达3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建概念：将代谢途径编码基因克隆和组装在质粒载体上进行表达，也称为质粒表达。优点：独立表达，代谢强度高，目标产物产量高，构建速度快，表达、调控灵活。缺点：遗传稳定性较低，代谢负担重；需要筛选压、诱导剂，下游分离成本高。游离表达分类：串联表达、融合表达、复合体表达、模块化表达、正交化表达等方式。3.1游离表达设计与构建串联表达：将代谢途径中的多个基因组装在一起的表达模式，在质粒上进行表达，可分为单顺反子和多顺反子表达。单顺反子表达模式：一个启动子驱动一个基因转录，3端下游为一个终止子。多顺反子表达模式：一个启动子驱动多个基因转录，一个终止子以结束转录。每个基因的5端上游非翻译区都必需具备核糖体结合位点。基因ARBST基因ARBS基因BRBS基因CRBST3.1.1串联表达游离表达设计与构建代谢途径构建游离表达设计与构建代谢途径构建一般地，单顺反子表达强度高于多顺反子，而且距离启动子越远，多顺反子中的基因表达有衰减效应。通常是2-3个基因串联，一般不超过5个基因组成多顺反子。原核细胞工厂设计中常用多顺反子表达策略，真核细胞工厂中常用单顺反子表达。3.1.1串联表达游离表达设计与构建代谢途径构建概念：将一个酶与一个融合标签或另一个酶通过连接肽连接起来，翻译后形成融合酶。常见的融合标签：六聚组氨酸（6×His）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、硫氧还蛋白A（TrxA）、N利用基质A（NusA）、二硫键形成蛋白（DsbA）、绿色荧光蛋白（GFP）、泛素、小泛素相关修饰物(SUMO）。3.1.2融合表达融合表达的目的：增加真核生物来源蛋白及难表达蛋白的表达量、可溶性和稳定性，便于分离纯化和功能鉴定等。荧光蛋白则用于表征目标蛋白或酶的细胞定位或表达量。游离表达设计与构建代谢途径构建基于标签肽的融合表达的设计：将标签肽放在对目标酶功能没有影响的N端或C端，标签肽与目标酶之间插入蛋白酶识别和切割位点序列。一般情况下，在亲和层析技术分离纯化融合酶后，使用蛋白酶切除标签肽，进行生化和酶学分析。融合标签表达的缺点：标签分子量大，影响酶的活性。3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建连接肽融合表达模式：酶ACN酶BNC酶ANC酶BNC酶ANC酶BCN3.1.2融合表达连接肽的作用：本身不具备催化功能，用于构建融合酶体系，除了增加酶的可溶性、稳定性外，还能使融合酶在空间上相互靠近，缩短中间代谢物转运距离，有效提高产物产量、产率和转化率，适合于多酶催化的代谢途径重构。游离表达设计与构建代谢途径构建柔性连接肽：不能形成特定二级结构的连接肽，在融合酶中一般是以无规卷曲的形式存在。通常富含甘氨酸残基，最典型的连接肽是(GGGGS)n(一般n=3-4，n≤6)。增加重复单元的数目，结构域间的距离变化不大，但隔离效果在不同融合蛋白中变化较大，往往需要个性化设计。柔性连接肽的特点：增加蛋白的有效折叠和可溶性，使各催化结构域互不干扰，因此得到最广应用。缺点是(GGGGS)n

具有舒展构象，有可能成为蛋白酶切割位点，导致融合蛋白的不稳定性。连接肽的分类3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建刚性连接肽：能形成相对稳定的二级结构的连接肽。如(EAAAK)n(一般n=2-5，n≤6)能形成α螺旋，增加重复单元数目，两个结构域之间的距离就越大。刚性连接肽的优点：提供相对稳定、可控的隔离效果，不是舒展构象，能减少了蛋白酶攻击，使得融合蛋白较为稳定。连接肽的分类3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建连接肽不能影响两个酶的各自的折叠空间结构；连接肽隔离两个酶活性中心的距离足够，不能使两个蛋白活性相互影响甚至受到抑制。过短的连接肽影响蛋白的正确折叠，容易形成无活性的蛋白聚体；过长的连接肽可能缠绕捆绑蛋白结构域，造成活性位点遮蔽，连接肽本身易被酶水解断裂。柔性连接肽适用于无相互作用的两种酶的融合表达，而刚性连接肽常用来固定两端蛋白的间距，保证功能域的完整，同时通过可调整连接肽的长度和组成获得最佳酶活性和稳定性。连接肽选择的基本原则：3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建对靶蛋白的N端或C端融合蛋白酶TEV的切割识别位点和蛋白降解标签，靶蛋白处于稳定状态。当蛋白酶表达后，蛋白酶识别位点被切割，降解标签裸露，靶蛋白转为不稳定状态，降低了靶蛋白丰度。蛋白水平调控的优点是比转录水平具有更短的响应时间和速度，缺点高ATP消耗。融合表达的其他应用：动态调控目标蛋白丰度。3.1.2融合表达游离表达设计与构建代谢途径构建酶复合体表达：以蛋白支架为骨架，通过蛋白-蛋白相互作用的设计，将分散的代谢途径酶在空间上募集在一起，自组装形成双功能甚至多功能酶复合体。酶复合体表达的优点：底物通道更短，级联催化的代谢效率更高；蛋白支架能特异性地高效结合，可用于两个或多个酶的空间组装；设计简便，通过改变蛋白支架上的结构域数量和位置，调控不同酶在复合体中的的相对比例，达到优化多个酶催化的代谢途径的目的。3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建蛋白支架：一个非催化亚单位，由具有相互作用的两个及其以上的结构域组成。设计策略：不同结构域之间通过柔性连接肽进行融合表达，则形成蛋白质支架。增加配体数目，可调控两个酶化学计量比例。已报道的支架蛋白有GBD-SH3-PDZ、RIAD-RIDD等。酶A连接肽结构域（配体-连接肽)n酶B(n=1)(n=3)酶A酶B酶A酶B酶A酶A3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建GBD-SH3-PDZ可用于三酶复合体表达。基于酶催化的反应顺序，酶A与GDB，酶B与SH3，酶C与PDZ配体融合表达。通过融合表达的不同配体与支架上的不同结构域的相互作用，三种酶按照反应顺序被固定在蛋白支架上。调控蛋白支架结构域的数量，优化三种酶的化学计量比，解决三酶表达量不平衡问题。酶A连接肽配体（连接肽-结构域A)x(连接肽-结构域B)y(连接肽-结构域C)z酶B连接肽配体酶C连接肽配体（x=y=z=1）（x=2，y=1，z=3）酶A酶B酶C结构域A结构域B结构域C酶A酶B酶C结构域A结构域B结构域C酶A酶C结构域A结构域C酶C结构域C3.1.3酶复合体表达游离表达设计与构建代谢途径构建RIAD-RIDD由1分子RIAD和二聚化的2分子RIDD组成，利用该支架可实现以2:1的比例进行双酶复合体表达。通过柔性连接肽，将酶A与RIDD，酶B与RIAD融合表达，复合体中酶A/酶B的数量比例为2:1。酶A连接肽-RIDD酶B(连接肽-RIAD)RIAD-连接肽

酶B连接肽-RIAD酶A酶A酶A酶A酶B酶A酶B酶A3.1.3酶复合体表达将酶B的N端C端分别与RIAD融合，则复合体中酶A/酶B的比例为4:1。反之，如果酶A与RIAD融合，酶B与RIDD融合，则可调控酶A/酶B的比例为1:2至1:4。游离表达设计与构建代谢途径构建模块表达：以模块为基本单元进行设计、构建、测试和优化代谢途径。模块表达的优点：(1)即插即用性，模块内部的不同基因可组合和替换，模块之间也可以组合和替换，具有很强的灵活性和可操作性。(2)易于发现代谢途径的瓶颈步骤，使用不同启动子、核糖结合位点等微调控模块内基因表达、使用不同拷贝数质粒协调模块间的表达，避免代谢不适配。(3)便于产品定制生产，是常用策略，特别适用于长途径的设计构建与优化。3.1.4模块表达游离表达设计与构建代谢途径构建代谢途径的模块化是为了代谢分工而划分的。模块化设计的要求：(1)模块是代谢途径中功能单元的集合，模块内部是相互关联的，模块之间的功能是相对独立的。(2)按照通用性原则进行标准化模块设计，使其具有兼容性和互换性，以便模块内部和模块之间的有效组合。(3)每个模块的输入底物或输出产物具有简便快捷的检测和分析方法，可单独表征模块的代谢效率。根据从底物到产物的生化反应，以关键中间代谢物为节点，对代谢途径进行模块划分和表达设计。3.1.4模块表达游离表达设计与构建代谢途径构建假设一条代谢途径由8基因组成，中间代谢物3、6的合成是途径的限制瓶颈，则可划分为三个模块。这三个模块可设计为单顺反子，使用不同启动子和不同的核糖体结合位点进行表达，分别检测分析中间代谢物3、6及终产物，以优化三个模块中每个基因的表达。在不同拷贝数的载体上，共表达三个模块，同时检测从底物到产物的生化代谢途径，协调模块间的表达强度，筛选出最适模块组合，实现整体代谢通量的最大化。底物酶A中间代谢物1酶B中间代谢物2酶C中间代谢物3酶D中间代谢物4酶E中间代谢物5酶F中建代谢物6酶G中间代谢物7酶H产物表达变量设计不同来源的同工基因调整基因表达顺序不同启动子不同RBS不同拷贝数第1模块第2模块第3模块基因ARBS基因BRBS基因CRBST基因DRBS基因ERBS基因FRBST基因GRBS基因HRBST第1模块第2模块第3模块游离表达设计与构建代谢途径构建正交表达：不依赖宿主细胞自身的转录、翻译、生长的表达模式。在大肠杆菌等微生物中，将T7RNA聚合酶基因整合在染色体上，用T7启动子驱动基因表达，与内源RNA聚合酶及其启动子驱动的基因表达形成正交关系，是最简单和常用的正交表达模式。T7RNA聚合酶的组成型表达对宿主有害，将T7启动子与lacO1组合形成受调控的杂合启动子3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建正交表达是将细胞生长与目标产物合成解偶联，使它们之间的相互作用和干扰最小化。以内源代谢物为节点，可构建正交途径。例1：以IPP和DMAPP为前体，表达橙花基焦磷酸合成酶（NPPS）和柠檬烯合成酶基因，形成正交柠檬烯途径。该途径与内源GPP用于细胞生长形成正交关系正交柠檬烯和橙花醇代谢途径IPP，DMAPPGPPNPP鲨烯葡萄糖细胞生长目标产物代谢途径NPPSGPPS橙花醇柠檬烯合成酶基础代谢途径柠檬烯3.1.5正交表达游离表达设计与构建代谢途径构建例2：以乙酰-CoA和丙二酰-CoA为前体，II型脂肪酸合酶（FAS）途径的代谢物为脂酰-ACP，而I型脂肪酸合酶的代谢物为脂酰-CoA，它们形成正交途径。用于在大肠杆菌和酵母中合成脂肪醇、长链烃、脂肪酸酯。正交脂肪酸途径乙酰-CoA，丙二酰-CoA脂酰-ACP脂肪烃脂酰-CoA脂肪酸葡萄糖细胞生长目标产物代谢途径I型FASII型FAS腊酯合酶醛基脱羧酶还原酶脂肪酸酯基础代谢途径脂肪醇3.1.5正交表达3.2染色体整合表达设计与构建染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.1染色体整合技术的原理3.2.2转座技术3.2.3单位点整合表达3.2.4多位点整合表达3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体整合表达：将代谢途径编码基因整合到在染色体的位点上进行表达。优点：遗传稳定性高，不使用筛选压、诱导剂，减轻了细胞工厂的代谢负担，降低了生产成本。缺点：代谢途径基因拷贝数较低，代谢强度较弱，目标产物的产量相对较低。染色体整合表达是酵母等真核细胞工厂的主要表达方式：基于整合机理，可分为随机整合和定点整合；基于染色体的组织结构变化，可分为插入整合和替换整合；基于整合位点的特性，可分为单位点整合和多位点整合；基于整合的拷贝数，可分为单拷贝整合和多拷贝整合。3.2染色体整合表达设计与构建染色体整合表达设计与构建代谢途径构建基于供体DNA的染色体整合机理，可分为位点特异性重组技术、同源重组技术、转座技术。位点特异性重组：在特定位点上切割DNA和重新连接，形成重组DNA分子。同源重组：具有同源臂的两个DNA片段之间发生断裂、交换、修复，引发DNA序列的插入、敲除和组装等重组事件。转座技术：将不同的CRISPR-Cas和转座子或转座酶有效组合起来，构建人工转座元件，可用于代谢途径基因的染色体整合表达。3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建位点特异性重组技术位点特异性重组：在特定位点上切割DNA和重新连接，形成重组DNA分子。3.2.1染色体整合技术原理双组分的Cre-loxP系统：环化重组酶（Cre）特异识别loxP两端的反向重复序列，并在间隔区进行切割，细胞内连接酶负责重组分子的连接。两个loxP位点方向相同时，Cre切断间隔区，使loxP位点之间的DNA片段发生删除方向相反时，发生DNA片段的反转。缺点：Cre切口处残留34bp的loxP序列染色体整合表达设计与构建代谢途径构建Cre的同源蛋白vCre和sCre分别特异性识别vloxP和sloxP也可用于重组。噬菌体来源的重组酶Dre识别32bp的DNA序列rox，包含两个14bp反向回文序列和4bp间隔序列。Dre重组酶不能识别loxP位点，Cre重组酶也不能识别rox位点。同时使用Cre-loxP和Dre-rox，进行多重特异性重组。其他位点特异性重组系统3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建Flp-FRT系统：Flp-FRT系统的重组过程与Cre-loxP相似，不需要辅助因子，稳定性良好，应用广泛。野生型和突变型的Frt之间可同时使用。其他位点特异性重组系统3.2.1染色体整合技术原理噬菌体来源的整合酶：如ΦC31整合酶，能将供体DNA整合在细菌染色体附着位点上。构建含有ΦC31整合酶基因的整合表达载体，整合片段长度达100Kb，主要用于放线菌。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建同源重组技术同源重组：具有同源臂的两个DNA片段之间发生断裂、交换、修复，引发DNA序列的插入、敲除和组装等重组事件。离体同源重组技术可用于代谢途径基因表达盒、多个表达盒组装、表达盒与质粒骨架的组装。同源重组能力强的微生物，如酿酒酵母，利用自身DNA修复的多种酶，向细胞内导入多个DNA片段和线性骨架质粒，可在胞内完成多个DNA片段的组装。3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建（1）线性双链DNA末端被核酸外切酶切割，形成粘性末端；（2）退火使相邻DNA片段的末端碱基配对，形成重组双链；（3）在DNA聚合酶催化下，修补单链的空缺；（4）DNA连接酶催化相邻两个碱基的磷酸二酯键连接，形成完整的重组分子。离体同源重组组装的过程3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建（1）染色体DNA断裂出现缺口（2）含有筛选标记基因的供体DNA与染色体同源交换和重组，引发染色体基因的敲除和替换，供体DNA被整合到染色体的同源位点上（3）回收或丢失筛选标记基因后，获得染色体基因敲除的人工细胞工厂多轮迭代，可敲除染色体上的多个基因。染色体基因敲除的基本过程3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体断裂的方式：一种是宿主细胞染色体复制或修复期间形成的断裂切口；一种是设计小向导RNA（sgRNA）序列，通过II型Cas核酸内切酶切割染色体产生切口。断裂效果多，重组效率高修复机制：同源末端连接机制，同源重组效率高；非同源末端修复机制，同源重组效率低；酿酒酵母等真核细胞，自身同源重组能力强，较容易实现染色体基因敲除和整合表解脂酵母是非同源末端连接机制，可通过增加同源臂长度和敲除非同源重组相关基因，提高供体DNA整合和基因敲除的构建效率。。同源重组能力差的原核细胞：通过表达噬菌体来源的相关重组酶、ΦC31整合酶等，促进供体DNA的整合和基因敲除。3.2.1染色体整合技术原理同源重组效率的影响因素：染色体整合表达设计与构建代谢途径构建根据宿主细胞同源重组能力、转化的难易程度，选择线性DNA片段或质粒作为供体DNA常用重叠延伸PCR、离体无缝多片段组装或胞内多片段组装的方法，构建供体DNA：上游同源臂－代谢途径基因－筛选标记－下游同源臂为了丢失或回收筛选标记基因，还需要在其上下游设计重组酶（常用Cre和Flp）的识别和切割位点（loxP和FRT）。该方法的缺点是有重组酶切割后的序列残留，即属于有痕整合。供体ＤＮＡ片段或质粒的制备3.2.1染色体整合技术原理染色体整合表达设计与构建代谢途径构建第一次是单交换，将质粒所有序列都插入整合到染色体上。第二次是双交换，存在两种情况：上游同源臂间的重组会使染色体恢复到野生型；下游同源臂间的重组会消除质粒元件，获得代谢途径基因整合的细胞。3.2.1染色体整合技术原理两次交换过程：染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.2转座技术转座子：一类可移动遗传元件，由末端反向重复序列和转座相关基因组成。转座子的构成：较短的插入序列元件只含有末端重复序列和转座基因。较长的复合转座子还携带cas基因、crispr序列、抗性标记基因等。转座子基本结构转座技术：利用转座子的机制进行染色体整合的生物技术。将不同的CRISPR-Cas和转座子或转座酶有效组合起来，构建人工转座元件，可用于代谢途径基因的染色体整合表达。通过gRNA靶向整合位点，由转座酶介导插入整合，增加在代谢途径基因组染色体上的拷贝数。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建设计构建gRNA和Cas核酸酶表达载体、转座酶基因表达载体。在代谢途径基因上游和下游分别设计转座子的两个末端同源序列，构建供体载体。如果代谢途径基因不长，利用天然转座子编码CRISPR-Cas的特性，可将转座酶和Cas系统、代谢途径基因集成在一个表达载体上。3.2.2转座技术染色体整合表达设计与构建代谢途径构建转座酶亚基TnsB、TnsC和TniQ形成复合物，相互作用引发转座。gRNA靶向链和非靶向链都能插入，但倾向于靶向链方向整合。3.2.2转座技术优点：可整合30Kb以上的代谢途径基因，适合于长途径的整合表达。缺点：插入位点处发生复制，上游末端序列比预期多6bp。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建转座技术是不依赖于同源重组的位点特异性整合。优点：不需选择标记基因，可多轮整合提高拷贝数10个以上;缺点：转座系统或转座体的组分多，设计构建相对复杂；同时由于转座子的移动性，人工细胞工厂的遗传稳定性受限。3.2.2转座技术转座技术与同源重组技术的比较染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.3单位点整合表达基于同源重组的单位点插入整合表达过程与基因敲除类似：染色体双链断裂供体DNA与染色体发生同源重组整合筛选标记基因的回收单位点整合表达：将代谢途径基因整合在染色体的一个位点上表达。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建是影响染色体整合表达的主要因素，染色体上不同位点的基因表达强度不同，表达差异达数百倍。大肠杆菌中，距离复制原点oriC位点越近，基因表达水平越高，而距离复制终止子越近，基因表达水平越低。真核微生物中，距离自主复制序列越近，基因表达越强，对整合表达也有正效应，而距离着丝粒或端粒，则降低基因表达。整合位点对细胞生长也有影响。3.2.3单位点整合表达整合位点的选择染色体整合表达设计与构建代谢途径构建染色体的热位点或中性位点：染色体整合对细胞工厂的遗传和生长影响要小或无影响，有利于代谢途径基因的高效表达，不能被削弱或沉默。非必需基因、基因间序列、竞争性途径基因、负调控基因、天然整合位点等是候选整合位点。对于原核细胞，基因框内敲除和代谢途径基因整合同步进行，以避免引起整合位点后染色体基因表达的极性效应。3.2.3单位点整合表达整合位点的选择染色体整合表达设计与构建代谢途径构建细胞之间及处细胞周期不完全相同，导致不同整合克隆之间的产物合成能力存在有差异，对整合克隆进行表达检测，筛选出高产的整合表达细胞工厂。同源重组修复机制主要发生在细胞周期的S期，较短的同源臂能实现较高的整合效率。非同源末端连接介导的染色体修复机制，主要发生在细胞周期的G1和G2期，整合的效率较低，需要较长的同源臂。随着整合代谢途径基因的数量和长度增加，整合效率随着下降。整合效率的影响因素3.2.3单位点整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.4多位点整合表达第一种策略是离散不同位点迭代整合表达。在染色体A位点整合后，再在B位点整合，依次将整个代谢途径基因整合在不同位点上。该策略的优点是遗传稳定性较高，缺点是构建细胞工厂的周期长。多位点整合表达：将代谢途径基因整合在染色体的多个位点上，进行表达。多位点整合表达主要有两种策略。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建优点：构建细胞工厂的时间短缺点：设计构建CRIPSR-Cas系统复杂，随着整合位点的增加，代谢途径基因的整合效率急剧下降。选择具有低毒性和高切割活性的Cas蛋白有助于提高整合效率。第二种策略是不同位点的多重整合表达。设计多个gRNA序列靶向不同的染色体位点，通过CRISPR-Cas蛋白介导，一次性将整个代谢途径基因整合在多个位点上。3.2.4多位点整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建3.2.5多拷贝整合表达多拷贝整合表达：代谢途径基因以多拷贝形式整合在染色体上，通过基因的剂量效应，强化表达。整合策略1：单位点的离散迭代整合或多重整合，多拷贝有限，设计和构建繁琐、耗时费力，整合效率低。整合策略2：多基因序列、重复序列作为整合位点，一步操作多拷贝整合。酿酒酵母等真核细胞：选择分散分布在染色体上的反转座子Ty元件的长末端重复序列和rDNA基因，作为多拷贝整合位点。染色体整合表达设计与构建代谢途径构建酿酒酵母含有大约250个δ位点，其中约200个是独立的或不完整Ty的δ位点。设计靶向δ位点的sgRNA，表达Cas。插入整合20-30kb的代谢途径基因，高达数十拷贝。酿酒酵母的δ位点整合过程：3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建酿酒酵母的rDNA基因高度重复，但rDNA内存在细胞必需基因。在不影响功能的前提下，具有高效重组和稳定的rDNA序列和基因间区作为候选的可整合多位点。酿酒酵母的rDNA位点整合过程：3.2.5多拷贝整合表达染色体整合表达设计与构建代谢途径构建原核细胞中染色体重复序列少，整合位点可选择两端具有反向重复序列的IS元件。应用同源重组技术，进行多拷贝整合表达。设计多个gRNA靶向不同的染色体位点，多拷贝的染色体整合表达。3.2.5多拷贝整合表达3.3调控回路设计与构建调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式3.3.2静态代谢途径调控回路3.3.3动态代谢途径调控回路3.3.4核糖开关调控调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式代谢途径调控回路的组成：调控信号的输入模块、信号传感模块、信号执行与输出模块。调控信号输入模块是向发酵体系直接添加化学诱导剂、使用温度和光等物理工艺条件。信号传感模块通常是转录因子，它与输入的调控信号发生相互作用。信号执行与输出主要发生在基因转录调控和RNA调控等两个基本层次上。代谢途径构建阻遏蛋白与启动子结合，代谢途径基因不转录，处于关闭状态。添加诱导剂后，解除阻遏，代谢途径基因启动转录，处于开启状态。3.3.1代谢途径调控的基本模式转录阻遏蛋白-诱导剂模式调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.1代谢途径调控的基本模式转录激活蛋白-诱导剂模式转录因子不结合与启动子，代谢途径基因不转录，处于关闭状态。添加诱导剂后，转录因子促进RNA聚合酶与启动子的结合，代谢途径基因启动转录，处于开启状态。调控回路设计与构建调控回路设计与构建代谢途径构建静态代谢途径：代谢途径置于开启或关闭的某一种状态的静止模式，不依赖于细胞生长及其环境变化而改变代谢的运行状态，如启动子、RBS、gRNA调控。动态代谢调控回路：代谢途径置于开启和关闭的交替模式，随着细胞内外的变化而快速改变代谢的运行状态。根据代谢运行状态，可分为静态代谢途径调控回路和动态代谢途径调控回路。3.3.1代谢途径调控的基本模式调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路静态代谢调控有两种方式，一种是组成型表达，另一种是开关。使用组成型启动子是最简单的静态代谢调控模式。静态代谢途径回路开关由转录因子表达盒、诱导启动子组成，调控代谢途径基因的开启或关闭。在无信号输入时，代谢途径基因处于关闭状态。在细胞生长的某一个阶段，输入调控信号，开启目标代谢途径基因转录表达。输入的信号包括化学物质和物理因子，相应地，基于输入信号的类型，可分为化学开关和物理开关。调控回路设计与构建代谢途径构建化学开关：输入IPTG，启动转录3.3.2静态代谢途径调控回路其他化学物质：抗生素及其衍生物，四环素和氧化四环素、红霉素、乳酸链球菌素等。碳源：阿拉伯糖、鼠李糖、红霉糖、半乳糖、甲醇、乙醇、甲烷等。酸碱变化的pH开关。碳源类诱导剂与微生物生长培养基中的葡萄糖之间存在吸收的竞争关系，葡萄糖往往会削弱此类诱导剂的代谢调控效果。调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路化学诱导剂通常在细胞生长的对数中期或后期加入到培养基中，其使用浓度与细胞密度、转录因子数量具有一定的正比例关系。化学开关的优点：使用方便，通过流加操作进入发酵罐，诱导效应快，1-2小时内实现表达。缺点：增加了发酵物料成本，如果使用抗生素诱导，还增加了环境保护的成本。化学开关调控回路设计与构建代谢途径构建温度开关：升高温度，开启代谢途径3.3.2静态代谢途径调控回路阻遏蛋白CI857与温度敏感L/R启动子是应用最广泛的温度开关。在30℃下，关闭代谢途径基因转录；而37-42℃下CI857不稳定，失去阻遏功能，从启动子上解离，开启基因表达。优点是容易实施，与现有的发酵罐相适应，无需改造设备。缺点是温控应答时间慢，如果在40℃以上诱导，细胞产生热激效应，蛋白错误折叠和形成含体，不利于细胞生长和产物合成，同时增加能耗和生产成本。调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.2静态代谢途径调控回路氧开关：厌氧开启代谢途径氧开关由低氧启动子和转录因子组成，如大肠杆菌nar启动子-FNR转录因子调控回路，好氧条件下关闭基因表达，在厌氧条件下，具有启动代谢途径基因表达的功能。氧控开关的优点是适应现有发酵过程，减少供氧、降低生产成本。适合于厌氧或微氧发酵产品，如乳酸、琥珀酸、丙二醇、丁二醇、丙氨酸等。调控回路设计与构建代谢途径构建(特定波长)光开关：开启代谢途径光开关由光敏转录因子（光受体）和光敏启动子组成。由光敏转录因子VP16-El222【小写字母l，不是大写I】与光敏启动子c120组成的回路中，在450nm蓝光下，转录因子El222结合黄素核苷酸后，吸收蓝光促进光氧电结构域相互作用，形成二聚化功能蛋白，结合到启动子c120上，激活基因表达。优点是响应速度快，1分钟光照即可起效，可逆、容易施加和去除，对系统干扰少。缺点是需要改造现有发酵罐，增加光照设备，高细胞密度限制透光性和均一性，影响光控开关的效应。3.3.2静态代谢途径调控回路调控回路设计与构建代谢途径构建3.3.3动态代谢途径调控回路基于细胞内代谢物水平和发酵环境信号的实时变化，将动态代谢途径调控回路分为代谢物开关和群体响应开关。代谢物开关：依赖于中间代谢物或产物浓度变化对代谢途径进行实时动态调控的回路，由响应代谢物的转录因子、启动子和代谢物组成。代谢物开关的优点：防止中间代谢物积累引起的细胞毒性和反馈抑制，平衡代谢通量分配，减少细胞工厂的碳源和能源的浪费和代谢负担，从而提高目标产物合成效率。调控回路设计与构建代谢途径构建FapR的N端结合fapO形成复合物，阻遏代谢途径基因转录。C端结合又能与丙二酰-CoA结合使复合物解离，解除FapR的阻遏作用。FapR与gap启动子的上游激活序列（uas）结合，激活gap启动子。用FapR上调的gap启动子和下调的T7fapO启动子可设计构建丙二酰-CoA动态双向开关，可调控细胞稳定期的丙二酰-CoA含量。3.3.3动态代谢途径调控回路丙二酰-CoA开关：由转录阻遏蛋白FapR与操纵基因fapO组成。调控回路设计与构建代谢途径构建在该调控模型中，根据不同类型细胞工厂和不同产物，设计不同数量的串联fapO或串联uas，可更加精准地动态调控丙二酰-CoA开关。丙二酰-CoA开关可应用于细胞生长和丙二酰-CoA衍生物合成的平衡调控中。其他代谢物开关：酰基-CoA、乙酰