第8章-思考题解析

第8章思考题解析简述基因表达调控的特点与层次。答：基因表达调控分为直接调控和间接调控两类。直接调控是调控者通过物理性直接作用，改变被调控者自身特性或组合方式,进而使其生物学功能发生改变的过程。间接调控则是由不同的直接调控按一定的逻辑顺序组合而来。直接调控过程具有物理性和有效性两个特点：① 物理性：直接调控依赖生物活性分子间的物理相互作用。已知的酶促反应、受体-配体识别、靶标识别等调控过程均要求调控者与被调控者之间存在一定程度的物理接触。这种接触涉及经典牛顿力学范畴中的多种相互作用方式,包括范德华力、氢键和共价键等。②有效性：直接调控中，调控者一定对被调控者的生物活性进行了改变。这种改变可能是激活其潜在功能，也可能是抑制其原有功能，或赋予其新的功能。这些改变将体现在由被调控者所介导的下一级调控中。真核基因表达调控的层次可分为染色质调控、转录调控、转录后调控、翻译调控及翻译后调控等多个层面。1.染色质调控(chromatinregulation)：染色质调控也称转录前调控，包括染色质修饰和染色质重塑等。由于转录仅能够高效地发生于呈松散状态的染色体(即裸露的DNA)之上，因此染色质调控直接决定了后续的转录起始和转录效率。2.转录调控(transcriptionalregulation)：转录调控是指对基因转录，即以DNA为模板合成RNA过程的调控。转录调控的程度通常可用转录物丰度进行粗略描述。相比其他水平的调控，转录调控研究起始最早，积累的知识也较多。3.转录后调控(post-transcriptionalregulation)：以转录后RNA的加工(RNAprocessing)和降解(RNAdecay)为主要调控对象。转录后的前体mRNA(pre-mRNA)需要经过必要的加工才能成熟，并离开细胞核进行翻译。mRNA的转录后调控直接决定了后续的翻译起始和翻译效率。4.翻译调控(translationalregulation)：翻译调控是指对以成熟mRNA为模板合成蛋白质的翻译过程的调控。翻译调控司以在不改变转录物丰度的前提下，通过影响蛋白质合成速率从而快速改变产物蛋白质的含量。翻译调控的水平通常用翻译效率(translationefficiency,TE)来描述，是指某个基因的总mRNA中与核糖体结合并进行翻译的mRNA所占比例。5.翻译后调控(post-translationalregulation)：翻译后调控指对新生肽链(蛋白质)进行的折叠、修饰、加工、分选、转运及降解等过程，是整个基因表达调控的最后一步。翻译后调控影响蛋白质的生物活性和特定功能。并决定一个蛋白质分子的命运。种类繁多的蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodificaiton,PTM)是翻译后调控的典型代表。简述何为外显子、内含子及其结构特点和可变调控。答：编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）。大多数真核基因都是由外显子和内含子两部分交替排列而成的。在一个结构基因中，编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起，而常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式。外显子-内含子连接区就是指外显子和内含子的交界或称边界序列，它有两个重要特征：（1）内含子的两端序列之间没有广泛的同源性，因此内含子两端序列不能互补，说明在剪接加工之前，内含子上游序列和下游序列不可能通过碱基配对形成发夹二级结构。（2）外显子-内含子连接区序列是高度保守的，该序列可能与剪接机制密切相关，是RNA剪接的信号序列。序列分析表明，几乎每个内含子5′端起始的两个碱基都是GT，而3′端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即：5′GT……AG3′。此外，内含子靠近3′端的分支点在切除内含子过程中页头重要作用。外显子与内含子的可变调控：①真核基因的原始转录产物可通过识别不同的剪接位点，产生不同的mRNA剪接异构体，翻译成不同的蛋白质；②有些基因选择了不同的启动子，或者选择了不同的多聚位点而使原始转录物具有不同的二级结构，产生不同的mRNA分子。简述DNA甲基化对基因表达的调控机制。答：DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，控制基因表达。（1）DNA甲基化抑制基因转录的直接机制：DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。（2）甲基化抑制转录的间接机制：CpG甲基化，通过改变染色质的构象或者通过与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合。（3）DNA甲基化与X染色体失活：失活的染色体上绝大多数基因都处于关闭状态，DNA序列都呈高度甲基化。简述RNA结合蛋白的特点与功能。答：RNA结合蛋白(RNA-bindingprotein,RBP)中典型的RNA结合结构域,包括了RNA识别基序(RRM,RNArecognitionmotif)、K同源(K-homology,KH)、双链结构域、锌指结构域以及其他大约30个丰度较低的结构域。RRM由80~90个氨基酸组成，具有β1alβ2B3a2β4的拓扑结构。单独的RRM与RNA结合特异性很高，通常需要多个结构域组合来定义特异性，因为单个RRM识别的核苷酸数量通常太少，无法定义唯一的结合序列。有些RRM还能结合ssDNA，以及介导蛋白质之间互作。RNA结合蛋白的功能：RNA结合蛋白通过一个或多个RNA结合结构域(RNA-bindingdomain,RBD)结合RNA，改变结合RNA的命运。RNA结合蛋白广泛控制RNA生命周期的每个阶段，包括mRNA的合成、成熟、剪切、降解等过程。简述反式作用因子的结构特点及其对基因表达的调控。答：反式作用因子有两种独立的活性结构域：DNA识别结构域（DNA-bindingdomain）和转录活化结构域（transcriptionalactivationdomain）。（1）DNA识别或结合域能够直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率。常见的结构有：①螺旋-转角-螺旋结构；②锌指结构；③碱性-亮氨酸拉链结构；④碱性-螺旋-环-螺旋结枃；⑤同源异形结构域。DNA识别结构域是反式作用因子结构中用来同顺式作用元件结合的结构区域，主要起结合DNA的作用。（2）转录活化结构域是反式作用因子结构中用来同其他蛋白因子结合，参与募集启动子结合蛋白形成转录起始复合体，控制基因转录活化的区域。转录活化结构域有多种，通常是DNA识别结构域以外的20～100个氨基酸残基组成。不同的转录活化结构域有下列特征：①带有负电荷的酸性α螺旋结构域；②富含谷氨酰胺的结构域；③富含脯氨酸的结构域。酸性α螺旋结构域通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合，生成稳定的转录复合物而促进转录；富含谷氨酰胺的结构域与GC盒结合调节转录；富含脯氨酸的结构域主要识别CCAAT盒。反式作用因子分为以下3类：具有识别启动子元件功能的基本转录因子、能识别增强子或沉默子的转录调节因子，以及不需要通过DNA-蛋白质相互作用就参与转录调控的共调节因子（transcriptionalregulator/co-factor）。简述RNA修饰的重要意义。答：RNA修饰包括加帽、多聚腺苷酸化、甲基化修饰等多种修饰方式。其意义主要包括以下几个方面：RNA加帽（RNAcapping）：是指在真核生物mRNA的5'端添加一个特殊的核苷酸结构（7-甲基鸟苷，m⁷G），并通过甲基化修饰形成5'端帽子结构（5'cap）。这一过程①提升mRNA稳定性，避免被细胞内的核酸外切酶降解；②在细胞中招募蛋白质翻译机器，使得mRNA翻译出蛋白质；③促进mRNA的运输；④提高RNA的剪接效率。多聚腺苷酸化(polyadenylation)：是指在底物RNA的3'端加上一段多聚腺苷酸的转录后修饰作用。多聚腺苷酸化修饰可能从以下几个方面来影响基因表达，①选择性多聚腺苷酸化可能产生差异性蛋白亚型；②不同转录物具有不同的3'-UTR,而3'-UTR是很多miRNA、RNA降解因子的重要靶标。这使得这些转录物具有不同的稳定性、翻译效率、运输或细胞定位。其他RNA修饰（m6A等）：N-甲基腺苷(N-methyladenosine,mA)是真核生物RNA最常见的mRNA修饰之一,即mRNA中腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰。能特异性地“书写”、“擦除”和“识别”mA,从而影响RNA的命运。①m⁶A修饰可影响mRNA的降解或稳定，从而调控翻译效率；②翻译控制，某些修饰（如m⁶A、伪尿苷）能促进或抑制翻译起始，影响蛋白质合成；③非编码RNA如tRNA和rRNA中的修饰（甲基化、硫修饰）对维持其结构和功能至关重要；④某些修饰可调节RNA的核酶催化活性。总之，RNA修饰是基因表达精细调控的关键机制，广泛参与生理病理过程，并为疾病治疗提供新靶点（如m⁶A修饰抑制剂）。其研究推动了“表观转录组学”这一新兴领域的发展。如何通过实验的方法分析CTD上S2和S5不同磷酸化pattern的功能？答：CTD是RNA聚合酶Ⅱ最大亚基羧基端结构域，它是由以7个氨基酸（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）为重复单位的高度保守的重复序列组成，磷酸化是CTD结构的一个非常重要的特点。Ser-2和Ser-5是氨基酸发生磷酸化的两个活跃位点。正是由于CTD结构中具有了这些可发生磷酸化的位点，所以才有了RNA聚合酶Ⅱ的两种不同类型RNAPⅡA和RNAPⅡO型。结构上的不同也直接影响了它们各自的功能：RNAPⅡA与mRNA转录起始的阶段有关，而RNAPⅡO则同转录的延伸过程有关。可以通过构建针对于S2和S5的磷酸化过程相关酶（TFⅡH、CDTK-I、Ser5PPPase）的特异性缺失突变体，检测mRNA转录过程以及mRNA转录产物的改变，进而检测不同的S2和S5磷酸化模式的功能。举例说明蛋白质磷酸化如何影响基因表达。答：蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程。蛋白质的磷酸化就是在蛋白质激酶的催化下，把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆过程则为去磷酸化，磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser、Thr、Tyr。通过cAMP介导的蛋白质磷酸化过程激活转录因子。这类基因的5′端启动区大都拥有一个或数个cAMP应答元件（cAMP-responseelement，CRE），其基本序列为TGACGTCA。在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。膜上的受体R与外源配基（ligand）相结合，引起受体构象变化，并与GTP结合蛋白相结合，R与G耦合激活了与膜相关的腺苷酸环化酶（AC），导致胞内cAMP浓度上升，活化PKA，释放催化亚基并进入核内，实施底物磷酸化。被磷酸化的底物，如CREB、CREM等，可作为转录激活因子诱发基因转录；C激酶与PIP2、IP3和DAG。IP3引起细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠近原生质膜内侧处，并被DAG和Ca2+的双重影响所激活。C激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，能对外界刺激做出更迅速的反应；CaM激酶及MAP激酶。Ca2+的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶（CaM-kinase）来实现，它们也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，但仅应答于细胞内Ca2+水平。MAP激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAP-kinase，又称为extracellular-signal-regulatedkinase，ERKS）活性受许多外源细胞生长、分化因子的诱导，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受体系统的调控。MAP激酶的活性取决于该蛋白质中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是否都被磷酸化。能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为MAP-激酶-激酶，它的反应底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，从而在信息传导中发挥功能。此外，Jun、E1K-1等为转录因子，其磷酸化状态的改变能够影响其后介导的基因转录起始与否；蛋白质磷酸化与细胞分裂调控。细胞通过p53及p21蛋白控制CDK（cyclin-dependentproteinkinase）活性，调控细胞分裂的进程。如果p21蛋白过量，大量周期蛋白（cyclin）E-CDK2复合物与p21蛋白相结合，使CDK2丧失磷酸化pRb蛋白的功能。没有被磷酸化的pRb蛋白与转录因子E2F相结合并使后者不能激活一系列与DNA合成有关的酶，导致细胞不能由G1期进入S期，细胞分裂受阻。如果细胞中p53基因活性降低，p21蛋白含量急剧下降，周期蛋白E-CDK2复合物就能有效地将pRb蛋白磷酸化。此时，pRb蛋白不能与E2F相结合，使后者发挥转录调控因子的作用，激活许多与DNA合成有关的基因表达，使细胞从G1期进入S期，引发细胞分裂。说明组蛋白乙酰化和去乙酰化影响基因转录的机制。答：核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4通过组蛋白N端“尾巴”上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体结构更加松散，使得转录调节蛋白更容易与染色质基因组的这一部分相接触；组蛋白乙酰化作用还能阻止核小体装配，使染色质处于比较松弛状态，有利于提高基因的转录活性。组蛋白去乙酰化则与基因活性的阻遏有关。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）Rpd3复合体专一性结合于某个或某类基因启动子区附近的组蛋白位点使之去乙酰化，导致染色质结构发生不利于基因转录的变化，核小体能相互靠近，在转录共抑制子的协同作用下，抑制基因的转录。组蛋白低乙酰化或去乙酰化伴随着转录沉默或转录抑制。说明分子伴侣的分类及其影响基因表达的机制。答：分子伴侣广泛存在于原核生物和真核生物中，在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用，参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立，但自身并不发生任何变化的一大类蛋白质分子。可以分为核质蛋白家族、Hsp70家族、Hsp60家族、TCP-1、Hsp90家族、Hsp100家族、分子内伴侣、周质分子伴侣、RNA分子伴侣等。它们影响基因表达的机制：通过与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异性表达。如许多生物在最适温度范围以上，能受热诱导合成一系列热休克蛋白（heatshockprotein）产生。在没有受热或其他环境胁迫时，热激因子（heatshockfactor，HSF）主要以单体的形式存在于细胞质和核内。单体HSF没有DNA结合能力，Hsp70可能参与了维持HSF的单体形式。受到热激或其他环境胁迫时，细胞内变性蛋白增多，它们都与HSF竞争结合Hsp70，从而释放HSF，使之形成三体并输入核内。HSF一旦形成三体，便拥有与HSE特异结合、促进基因转录的功能。这种能力可能还受磷酸化水平的影响，因为热激以后，HSF不但形成三体，还会迅速被磷酸化。HSF与HSE的特异性结合，引起包括Hsp70在内的许多热激应答，基因表达大量产生Hsp70蛋白。随着热激温度消失，细胞内出现大量游离的Hsp70蛋白，它们与HSF相结合，形成没有DNA结合能力的单体并脱离DNA。例如，受热后，果蝇细胞内热激因子HSF与hsp70基因TATA区上游60bp处的HSE相结合，诱发Hsp70mRNA转录，转录水平可提高1000倍。简述生物大分子互作在基因表达调控中的意义。答：生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质及非编码RNA等）之间的相互作用是基因表达调控的核心机制，通过动态、精确的互作网络实现对转录、翻译及表观