第二章-蛋白质的定性定量分析课件

第二章蛋白质的定性定量分析

蛋白质定性分析

(qualitativeanalysis)

确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质

蛋白质定量分析

(quantitativeanalysis)

确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量

蛋白质含量的测定方法（重点掌握）

蛋白质相对分子量测定(SDS)

等电聚焦电泳(IEF)（一般了解）

蛋白质的免疫印迹分析

(westernblot)

蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%一、紫外光谱(A280)吸收法

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收优点快速缺点核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以起误差对蛋白质无破坏性不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液

二、考马斯亮蓝G-250检测法

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法所需时间10min优点快速（反应时间仅需2min）敏感，几乎没有蛋白质损失缺点用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性对各种纯化蛋白质反应不同三、Lowry检测法

这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.原理

首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量优点一种可靠的蛋白质定量方法不同蛋白质之间差别很小缺点某些试剂不稳定干扰物质多使蛋白质发生不可逆变性计算方法标准曲线法注意事项在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱许多干扰物质降低颜色反应高盐浓度可引起沉淀四、BCA(二喹啉甲酸)检测法

这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法优点检测敏感性高缺点蛋白质发生不可逆的变性终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰第二节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱(ESI-MS)3.SDS基本原理SDS

影响迁移率的因素

十二烷基硫酸钠

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸钠

(SodiumDodecyl

Sulfonate

)

SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异4.SDS测定分子量的操作标准品的选择及处理待测样品的制备电泳分离及染色相对迁移率的计算WatchSDS操作AnalysisforSDSelectrophoresis5.注意事项选择合适的胶浓度样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去

SDS与蛋白质之间的结合程度蛋白质的分子量范围15～200KD之间二硫键是否完全被还原溶液中SDS的浓度溶液的离子强度二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1.基本原理2.凝胶过滤测定分子量的操作分子筛效应

洗脱体积与相应分子量的关系装柱平衡加样平衡洗脱收集样品并计算Ve绘制标准曲线3.注意事项柱床表面不能干燥

凝胶的选择

Sephadex

溶胀

G值的意义凝胶柱的再生与保存第三节

等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点等电点(isoelectricpoint,pI)两性电解质性质支持介质(supportingmedia)FigureofIEF+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusingReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mmBroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRangepH4.7-5.931044774.75.94.75.9注意事项两性电解质的选择

电极缓冲液

对样品的要求

样品必须无盐

加样的量要适当

加样方法

加样位置第四节

蛋白质的免疫印迹分析

印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测印迹技术的类别及应用

DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析

RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析

蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)一、免疫印迹分析的应用对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行半定量分析信号转导分析生物大分子相互作用分析将蛋白质固定在膜上的其他应用

结构域分析斑点印迹抗体纯化为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析二、免疫印迹分析的基本流程

电泳分离蛋白

转移至固相膜

封闭非特异结合位点

与第一抗体温育反应

与第二抗体交联物温育反应

显色制备蛋白样品蛋白质转移抗体检测免疫印迹操作流程图1.样品的制备

组织或细胞中提取

裂解

去污剂(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白质的定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程表达重组产物2.电泳分离

SDS

非变性PAGEEIF3.蛋白质的电转移方法：半干法、湿法作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡！？常用的蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.45um80-100ug/cm2应用广泛<20kD易丢失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480ug/cm2用于核酸电转移装置电转移示意图电转移装置4.靶蛋白的免疫学检测封闭

—对转移膜上的潜在结合位点进行封闭，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色BSA、脱脂奶粉

靶蛋白与第一抗体反应—单抗、多抗

注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等作用：排除假象

与第二抗体反应第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)胶体金标记、125I标记标记

显