硫酸马钱子碱促兔软骨细胞增殖的研究

目录TOC\o"1-3"\h\u30179摘要 硫酸马钱子碱促兔软骨细胞增殖的研究摘要：目的：研究硫酸马钱子碱（brucinesulfate,BS）对体外培养兔软骨细胞增殖作用的影响。方法：分离、培养健康兔的软骨细胞，用甲苯胺蓝染色法检测并鉴定细胞类型，采用MTT法检测细胞增殖情况。结果：MTT实验结果显示，0.1ug/ml和0.2ug/ml的硫酸马钱子碱对软骨细胞有最大增殖作用，最高增殖率为15%。且随着浓度增加，药物对软骨细胞的增殖作用下降。结论：硫酸马钱子碱在特定浓度范围能有效促进兔软骨细胞的增殖，随着浓度的不断增加增殖作用下降。关键词：硫酸马钱子碱；软骨细胞；细胞增殖StudyontheproliferationofrabbitchondrocytesinducedbybrucineAstract:Objective:Tostudytheeffectofbrucineontheproliferationofrabbitchondrocytesinvitro.Methods:Isolateandculturerabbitchondrocytes,detectandidentifycelltypeswithtoluidinebluestaining,anduseMTTmethodtodetectcellproliferation.Results:MTTexperimentalresultsshowedthat0.1ug/mland0.2ug/mlbrucinesulfatehadthemaximumproliferationeffectonchondrocytes,andthemaximumproliferationratewas15%.Theproliferationofchondrocytesdecreasedwiththeincreaseofconcentration.Conclusion:Brucinesulfatecaneffectivelypromotetheproliferationofrabbitchondrocytesinaspecificconcentrationrange,andtheproliferationdecreaseswiththeincreaseofconcentration.Keywords:brucine;chondrocyte;cellproliferationg前言1.1马钱子植物概述马钱子（番木鳖）是一种乔木植物，属双子叶植物纲。成熟种子是植物马钱长籽马钱的入药部位，其味苦、性温、无臭味，但毒性较大。有通络止痛、散结消肿[2]之功效。叶子近圆形草质状，表面光滑无毛，脉络呈网状结构。果实呈钮扣状，成长过程中由绿色变为橙色。种子含量较多，圆盘形外观，表面被有茸毛呈灰黄色。一般生长在热带，多分布在我国台湾、福建和云南等地。1.2马钱子化学性质马钱子种子含有多种生物碱，其主要化学成分是吲哚类生物碱类,其中士的宁（strychnine）和马钱子碱（brucine）为主要的两大活性成分，士的宁约占总碱的45%，马钱子碱约占总碱的40%，以及其他微量生物碱，如异番木鳖碱、伪番木鳖碱、伪马钱子碱马钱子新碱等[1]。1.2.1士的宁士的宁是中药马钱子含量最高的一种弱碱性的吲哚类生物碱。呈白色结晶状或粉末状，味极苦并带有剧毒，可溶于氯仿、乙醇，难溶于水和乙醚等，具有复杂的化学结构，包括七个环系和六个手性中心[1]。士的宁作为马钱子中含量最高的生物碱，已被证实可用于癌症、弱视、偏瘫、炎症、骨细胞等多种疾病的治疗，但士的宁无镇痛作用。图一士的宁分子结构式1.2.2马钱子碱马钱子碱是仅次于士的宁在马钱子含量的吲哚类生物碱，无色晶体状，毒性较大且有刺鼻气味，对人体有害，可用作杀虫剂。医学上作为中枢神经系统的兴奋剂使用，具有良好的中枢镇痛作用和外周镇痛抗炎疗效，且镇痛活性很强[2]。图二马钱子碱分子结构式1.3软骨及软骨细胞软骨（cartilage）包括软骨细胞、基质和纤维和软骨膜。软骨包括生长部和休止部，这两部分都可以分离出软骨细胞并在体外培养条件下生长。软骨细胞（chondrocyte）以不同形态分布在软骨组织中，软骨组织的表层是单独分布，呈扁椭圆形且体积较小的不成熟细胞，由外及里可见软骨细胞体积增大。成熟的软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而来并成群分布于软骨陷窝内软骨细胞在电镜下可观察到有突起和皱褶，组织在体外切片中收缩为不规则形且软骨囊和细胞之间存在较大的腔隙。体外培养的休止部软骨细胞形状类似于纤维细胞状，没有形成软骨基质的功能。生长部软骨细胞具有合成软骨基质、纤维和成骨细胞的功能和特性，其在体外培养条件下生长和代谢较为活跃。体外培养的软骨细胞大多呈多角形状，很像上皮样细胞，形成的细胞外基质具有折光性，原代细胞长满后可进行传代培养[3]。临床研究显示，自第一例软骨细胞移植成功后，软骨细胞治疗和修复软骨损伤等疾病得到广泛应用并不断革新，较传统疗法有更理想的效果。1.4软骨损伤软骨损伤包括：退行性关节软骨损伤、关节软骨或骨软骨缺损、局灶性关节软骨损伤。关节软骨损伤在我国是一种较为常见的骨科疾病，由于关节软骨损伤发病率高，目前还不能完全根治，因此成为国内外骨科研究者关注的热点。传统治疗方法大部分是物理治疗、手术和药物治疗，只能暂时缓解症状，不能根治，严重时可导致退变。近年来，在较为前沿的科学研究中出现新的特殊材料以及研究方法，比如软骨细胞的培养，为软骨损伤的修复带来更好的解决方案[4]。1.5选题目标与内容1.5.1选题目的马钱子碱作为马钱子主要成分之一，因其毒性远小于士的宁，且其药理作用广，因此成为近年来的研究热点。《本草纲目》和《中药志》都有记载马钱子可治伤寒和恶疮、解热、消肿和治疗咽喉等疾病。现代临床研究表明，马钱子碱具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、兴奋中枢神经和保护骨关节的作用。本课题组通过检测硫酸马钱子碱对兔软骨细胞增殖的影响，并了解其作用机制，从而更好地挖掘马钱子碱的药用价值。1.5.2研究内容以BS为实验药，提取并培养健康兔的软骨细胞作为研究对象，用甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞的存在，通过MTT比色实验测定药物的IC50以及BS对兔软骨细胞的增殖作用。1.5.3研究现状及进展研究发现，硫酸马钱子碱可促进体外培养的兔软骨细胞的增殖，并能促进软骨细胞DNA的合成、胶原蛋白的分泌，调节软骨细胞的生长和代谢作用。张梅等发现马钱子碱能抑制兔软骨细胞的凋亡，实验通过马钱子碱干预NO诱导兔软骨细胞凋亡的方法[5]。其他研究结果表明，在体外SNP诱导大鼠软骨细胞凋亡模型中，通过抑制细胞色素C（Cytc）从线粒体中释放，降低蛋白Smac的表达，从而起到保护软骨的作用[6]。宋晓亮等发现，马钱子碱在体外能有效促进人软骨细胞的增殖与分裂，对NO抑制软骨细胞增殖有拮抗作用[7]。徐强等通过注射马钱子碱稀释液到关节腔内，可促进软骨损伤的修复[8]。综上，马钱子碱对家兔、大鼠到人软骨细胞的研究均充分认证了其诱导细胞增殖、改善细胞功能和促进创伤愈合的作用。1.5.4选题意义随着我国交通、体育事业的飞速发展和老龄化社会进程的加快迈进，关节创伤、劳损、退行性病变的发生率逐年增加。由于软骨的再生和修复能力极其有限，一旦缺损几乎无法愈合，严重影响人们的生活质量和幸福指数。普通的治疗方法效果达不到理想的效果，而中医药在治疗关节软骨损伤性疾病方面积累了丰富的经验。中药马钱子在临床上对以关节软骨损伤为特征的骨关节炎有很好的疗效。马钱子碱是从中药马钱子种子中提取的生物碱，药理研究表明马钱子碱具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫、促进创伤愈合等作用。因此，通过研究马钱子碱促进软骨细胞增殖的作用机制，可以为软骨损伤的治疗提供更多思路。第二章材料与方法2.1实验药品表一药品与试剂药品与试剂生产厂家硫酸马钱子碱DMSODMEM/F12培养基进口胎牛血清青链霉素双抗溶液0.25%胰酶PBS磷酸缓冲液甘油MTT粉末4%多聚甲醛甲苯胺蓝粉末SigmaSigmaGibcoGibcoGibcoGibcoGibco浙江省凤凰化工股份有限公司SolarbioWellbioscienceSolarbio2.2实验仪器与设备表二仪器与设备仪器名称厂家SW-CJ-2F双人单面垂直净化工作台XDS-600C倒置显微镜L-100XP超速离心机ZKXFB-1电热真空干燥箱XSP-2CA双目生物显微镜移液枪T25/T75细胞培养瓶一次性无菌吹打管细胞培养96孔板载玻片无菌无酶EP管苏州安泰公司上海蔡康贝克曼公司上海树立仪器仪表有限公司上海光学仪器厂艾本德CorningCorningCorningWellbioscienceAxygen2.3实验方法2.3.1主要药物配置：3.1.1DMEM:F12细胞培养液：DMEM:F12(1:1)培养基+10%进口胎牛血清（FBS）+1%双抗(PS)，4℃密封保存。3.1.2BS母液：称取一定量的BS溶于DMSO中，配置成400mg/ml的母液，涡旋混匀，4℃密封保存。3.1.3细胞冻存液：10%DMSO+进口胎牛血清，现配现用。3.1.4PBS溶液的配制和保存3.1.4.1试剂用途：作为溶剂，形成含有盐离子的缓冲溶液。实验中主要用来溶解保护试剂的作用。3.1.4.2溶液配制：

按1L的标准量配制称取下列药品：表三药品及用量NaCl8.0gNa2HPO41.15gKCl0.2gKH2PO40.2g3.1.4.3应用：可用50ml无菌离心管对PBS进行分装，在4℃环境下保存。实验室使用0.22μm的除菌膜过滤灭菌，使用过程中为了防止污染，保证严格的无菌操作。2.3.2兔软骨细胞的提取及培养2.3.2.1软骨细胞的提取1、实验用品：眼科剪、组织镊、培养皿、离心管、0.2%胶原酶、PBS、0.25%胰蛋白酶、75%酒精、F12培养液（含10%FBS，1%PS）2、提取步骤：2.1、处死白兔，取兔双膝关节，留少许软组织，注意不能破坏关节囊，75%酒精浸泡5min；2.2、在超净工作台内用无菌纱布擦拭，PBS冲洗，剔除多余软组织，更换刀片，打开关节囊，用刀片削取胫骨平台及股骨髁下软骨，将软骨浸泡在PBS溶液中，用眼科剪将软骨剪碎（0.3mm³），PBS溶液冲洗三遍；2.3、加入2ml、0.25%胰蛋白酶在37℃摇床中消化20min；2.4、胶原酶消化（分步消化）：2.4.1、将组织块放入2ml、10.2%胶原酶消化5min，弃上清液；2.4.2、加入4ml胶原酶，37℃恒温震荡水浴箱培养30min，弃上清液；2.4.3、用上述方法再培养90min，收集上清液，离心10min，弃上清液，中止消化，收集细胞。2.5、用培养基将细胞混匀后，转移至细胞皿中，加培养基至10ml，轻摇混匀，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。2.3.3软骨细胞的培养2.3.3.1细胞的冻存

细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。

1、具体操作如下：1.1取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液；

1.2在1000～1500rpm，5min离心洗涤；

1.3加入含10%DMSO冻存液，冻存液用10％DMSO+90%血清；

1.4将冻存液加入到冻存管中；

1.5熔封；1.6将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，先置于4℃条件下30min，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜，第二天将细胞置于液氮中；1.7作好冻存的细胞名称、代数、冻存日期和存放位置等记录。2、注意事项：

2.1、实验过程中，发现软骨细胞的冻存比较特殊，用培养液加10%DMSO冻存的软骨细胞不能复苏，最终用纯胎牛血清加上10%DMSO去冻存。2.2、常温下，DMSO是有毒物质，其本身就有灭菌的作用，使用前不需要再进行高压灭菌，否则会破坏它的分子结构，使其冷冻保护效果减弱。故在配制时做好防护工作，最好戴上手套和防护服在通风柜操作。

2.3、冻存细胞不宜在低温范围内放置过久，容易造成低温损伤。

2.4、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

2.5、细胞在液氮中理论上可以无限保存。被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内进行一次复苏，已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存，观察细胞对冻存的适应性，但反复复苏对细胞不利。2.3.3.2细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中解冻，待冻存管中冰块全部溶化后；消毒后的冻存管开封后移入离心管，常温下800rpm/min,3min离心；细胞计数；无菌台上操作，接种培养瓶培养，轻轻摇晃瓶身，使细胞分散均匀。用酒精擦拭瓶身后放入无菌培养箱中，第二天取出观察。

2.3.3.3细胞传代：细胞的生存空间一旦受到限制，就会影响到细胞的继续生长和生存。培养的软骨细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养物、代谢物逐渐消耗和积累，培养液有澄清的透明液体变为黄色浑浊液体。细胞之间密度过大，影响生长，这时就需要分离出一部分细胞并更新培养液，培养液的更新过程就叫做传代。

1、传代前准备：

1.1、把装有培养液、PBS和胰酶的瓶子放入37℃水浴锅内进行预热。提前打开超净工作台的紫外，灭菌30min，关掉紫外。1.2、进入经过紫外线照射的超净工作台前用75％酒精将双手和需要放进超净工作台药品和仪器多次消毒；

1.3、开始操作之前将实验仪器正确有序摆放，便于操作而且可减少交叉污染；

1.4、准备好将传代使用的已灭菌的空培养瓶和一次性吸管；

1.5、取出培养箱预热好的培养液，用酒精纱布擦拭后方能放入超净台内，传完代放回培养箱；

1.6、镜下观察细胞：从培养箱内取出细胞，取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精纱布擦拭培养皿和显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做记录。2、胰蛋白酶消化：

2.1、将瓶盖用酒精多次消毒后，在超净工作台内打开瓶盖，瓶盖口朝上远离操作区域放置，小心吸出旧培养液后丢弃；用DPBS吹打2次（洗掉旧培养基，防止中和胰酶），沿无细胞的一面瓶壁缓缓加入适量0.25%胰酶液消化，加入消化液的量刚好覆盖住细胞，轻轻摇晃瓶身；放入37℃培养箱消化半分钟取出，显微镜下观察；

2.2、倒置显微镜下观察细胞消化后的细胞，若细胞变圆、脱落，细胞相互之间分离，则说明此时细胞消化状态较好。3、用吸管轻轻吹打成细胞致细胞脱落，避免吹打过程中出现泡沫，否则会损伤细胞。按传代比例细胞密度弃去部分消化液，一般留少量消化液在瓶内，轻轻拍打培瓶身，使细胞均匀分散，然后加入新鲜的培养液。4、分装、稀释细胞：

4.1、将培养皿中细胞悬液吸出分装至多个培养瓶中，加入适量培养基后旋紧瓶盖；

4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时细胞计数。密度过小则会影响传代细胞的生长，因此传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要在瓶上做标记，如细胞代数、日期及姓名等。5、继续培养：

5.1、用酒精棉擦拭培养瓶，旋松瓶盖，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后细胞开始贴附在瓶壁上。6、悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体大部分吸掉，留下少量，重新加入新鲜培养液。当细胞悬液中杂质或颗粒物较多时比较浑浊，可以将悬液移到离心管内，离心3分钟，弃上清液，加入新制培养液，吹打均匀，移入培养瓶中。然后置于37℃，5%CO2培养箱中培养。2.3.4细胞计数

2.3.4.1具体操作如下：1、准备工作：取一瓶可以传代的细胞，按上述传代方法繁殖细胞，待长成单层细胞后使用。2、细胞悬液的制备方法：用0.25％胰酶消化，PBS液洗涤，加入培养液中止消化，吹打成单细胞悬液。细胞计数：

3.1、准备一套血球计数板，用擦镜纸擦净，将专用的盖玻片盖在中央计数室上。

3.2、制备计数用的细胞悬液：吸适量细胞悬液到一支离心管中，滴入一滴的台盼蓝染液混匀后静置几分钟。加入染液后可以在显微镜下区别活细胞和死细胞，死细胞过多需要重新配制悬液。

3.3、用吸管将待测细胞悬液反复吹打均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，保证盖片下充满悬液。

3.4、计算原细胞悬液的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的活细胞数目。按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104

3.6、细胞计数要求：

3.6.1取样计数前，应充分混匀细胞悬液，进行细胞计数时，如果细胞数目过少要进行离心再取悬液；

3.6.2数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线

3.6.3操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，都会影响计数的准确性。2.3.4细胞活力的测定MTT比色实验：

原理：检测细胞的存活和生长，可测定测药物（病毒）的IC50。四甲基偶氮唑盐(MTT)被琥珀酸脱氢酶催化，还原成紫色不溶性结晶物并沉积于细胞中，活细胞数目和功能状态与紫色不溶性结晶物形成的多少有关。用酸性异丙醇或DMSO溶解紫色不溶性结晶物后，测定光吸收值（酶标仪）。1、MTT的配制：称取MTT粉末250mg溶解于50mlPBS或生理盐水中，充分搅拌，60℃水浴助溶，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后分装后在-20℃避光保存。2、取对数生长期的软骨细胞，弃旧培基，PBS润洗两次，0.25%胰酶消化（37℃培养箱，30s），加入完全培基终止消化，取细胞悬液稀释一定倍数，细胞计数。配置浓度为3×104个/ml的细胞悬液，96孔板每孔加入100μl细胞悬液（每孔3×103个细胞）。孔板四周不加细胞，加100ulPBS，同时设置调零孔和空白对照组。3、观察细胞贴壁后，弃掉培养基，PBS清洗两次，按药物浓度梯度每孔加100μl含药培养基，置培养箱培养24~72小时。4、MTT染色4.1、每孔加入20μlMTT（5mg/ml）,培养箱继续培养4小时。（若药物与MTT反应，先弃去含药培基，再加入培基和MTT，一块板子大约需要2mlMTT）4.2、轻轻吸去孔中溶液，每孔加入150μLDMSO溶解，微震仪震荡10min，蓝紫色结晶完全溶解后用酶标仪测定吸光度。4.3、用酶联免疫检测仪（DNAExpert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值（OD值），按公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率或增值率：抑制率（％）＝（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值×100％

4.4、求出各药物（或病毒）特定浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；通过GraphPadPrism7软件，采用Logit法计算IC50。2.4软骨细胞鉴定2.4.1甲苯胺蓝染色2.3.5.1染色原理软骨细胞分泌的基质所含有的蛋白聚糖成分可以被甲苯胺蓝染色。染色后通过确定细胞内所含成分而确定细胞类型及其特性。2.3.5.2染色方法试剂：甲苯胺蓝粉末、冰醋酸液步骤：2.1称取0.1g甲苯胺蓝粉末，并配置一定量的醋酸盐缓冲液，两者混溶；2.2组织切片用蒸馏水浸洗后用甲苯胺蓝液浸染；2.3用蒸馏水冲洗掉多余染液，再进行酒精脱水；2.4用二甲苯透明；2.5中性树胶固定。第三章结果与讨论3.1软骨细胞的形态学特征分离培养的兔原代软骨细胞在贴壁前整体呈悬浮状态，多为透明圆球形，放置24h内即有部分贴壁，贴壁后细胞呈三角形或多角形，48h后大部分贴壁形成单层，6天可长满瓶底80%左右后可传代[22]。一般传代后第3天后便长满然后继续传代，前四代细胞长满瓶底时可观察到镜下呈“铺路石”样形态，细胞之间紧密相连。第五代以后，细胞形态开始发生变化，大多呈长梭形或长多角状形态，而且生长速度逐渐减慢或停止生长。3.1.1显微镜下传代过程中软骨细胞形状显微镜下观察到传代过程中兔软骨细胞形态变化比较显著，原代细胞大多数呈透亮的圆形，第一代到第四代软骨细胞生长速度较快，从圆形变为多角形，细胞之间分离，部分细胞变得细长。培养至三、四代以后，细胞增殖速度逐渐减慢，细胞间隙增大，细胞形态也逐渐变为梭形、多边形或不规则形状。如下图：原代第一代第二代第五代图三兔软骨细胞传代过程细胞形态3.1.2甲苯胺蓝对软骨细胞的鉴定图四为三种不同倍镜下甲苯胺蓝对兔软骨的染色情况。图中可以清晰看到软骨细胞呈蓝紫色，细胞周围有异染颗粒，细胞之间着色深浅不同是由于细胞分泌基质含量不同。如下图：图四倒置显微镜下兔软骨细胞3.2马钱子碱对兔软骨细胞增值的影响3.2.1、计算半浓度抑制率分析数据可知，当抑制率在50%时，BS浓度在0.05-0.1mg/ml之间，应用GraphPadPrism7软件绘制抑制曲线（图五），并计算得IC50=0.08644mg/ml。图五不同浓度硫酸马钱子碱对兔软骨细胞的增殖抑制曲线从图五可以看出作用48h和72h后，BS浓度在0.01mg/mL至1mg/mL之间对软骨细胞均有抑制作用，并呈时间依赖性和浓度依赖性。因此，我们继续考察BS浓度在低于0.01mg/ml时对软骨细胞是否具有促进增殖的作用，并以72h作为药物干预时间点。图六细胞生存曲线从图六可以看出，BS浓度在0.02ug/ml至0.8ug/ml范围内对软骨细胞均有促进增殖作用。BS浓度为0.1ug/ml时，对软骨细胞的增殖效果最佳，最大增殖率为15%。第四章结论与展望4.1结论这次通过实验观察硫酸马钱子碱对兔软骨细胞的作用观察指标来反映马钱子的治疗作用通过。建立软骨细胞培养体系，探讨马钱子的主要成分马钱子碱对兔软骨细胞增殖的影响。在实验过程中，我们将不同浓度马钱子碱加入正常兔软骨细胞中，以了解他们对于正常软骨细胞是否有诱导其凋亡或促进其增殖作用，以及在不同浓度的药物作用下对诱导细胞凋亡或促进细胞增殖的程度。为了观察马钱子碱对正常软骨细胞增殖的影响。通过计算IC50可知，作用48h和72h后，BS浓度在0.01mg/mL至1mg/mL之间对软骨细胞均有抑制作用，并呈时间依赖性和浓度依赖性。采用MTT法来反映软骨细胞存活和生长，BS浓度在0.02ug/ml至0.8ug/ml范围内对软骨细胞均有促进增殖作用，BS浓度为0.1ug/ml时，对软骨细胞的增殖效果最佳，最大增殖率为15%。且随着浓度增加，BS对软骨细胞的增殖作用下降。所以马钱子碱能够在一定浓度范围内有效地促进体外培养兔软骨细胞的增殖。4.2展望在这个科技与医学发展的快速时代，人们生活的健康和品质越来越得到重视，新的制备和研发也受到人们的青睐。近几年，中药逐渐进入更多研究者的视野，中药的治疗也迅速成为一个热点。我国中药资源丰富且应用广泛，为多种疾病的治疗打下了物质基础。由于软骨细胞分化后丧失分裂能力，软骨损伤后很难再恢复，因此软骨损伤的治疗成为一个难题。近年来的研究表明中药马钱子可以促进软骨细胞的增殖，为软骨损伤等疾病带来了新的突破，但还存在不足之处。相信在不断研究中药将克服劣势，不断被挖掘出其优势，为人类健康做出贡献。参考文献[1]何丽丽.士的宁及其离子对贴剂研究[D].湘潭大学,2019.[2]杨薇.马钱子碱贴剂研制及局部镇痛与传递研究[D].湘潭大学,2017.[3]陈百成,张洪斌,张汉杰,郑淑梅.生长因子对软骨细胞的作用[J].中华骨科杂志,1999(12):746-748.[4]徐杨俊,赵建宁.关节软骨损伤修复的研究进展[J].医学研究生学报,2010,23(08):889-894.[5]张梅,李平.马钱子碱对兔软骨细胞增殖的影响[J].安徽中医学院学报,2003(03):39-41.[6]高萌萌,张梅.马钱子碱对体外软骨细胞凋亡线粒体途径的影响[J].中國中醫骨傷科雜誌,2007,15(12):1-4.[7]宋晓亮.马钱子碱对体外培养的人软骨细胞增殖的影响[D].山西医科大学,2013.[8]徐军,刘强,宋晓亮,李卿源.马钱子碱液关节腔内注射对兔膝关节损伤软骨的影响[J].中国医药指南,2013,11(18):9-10.[9]吴建方.分析马钱子对骨关节炎中软骨细胞凋亡与增殖的影响[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(77):167+175.[10]柳海平,周明旺,李盛华,叶丙霖,吉星,柴喜平,陈威,吴献毅.骨关节炎软骨细胞增殖相关信号通路研究进展[J].中国矫形外科杂志,2018,26(23):2163-2166.[11]胡烈奎,王立新,彭力平,马笃军,廖州伟,李媛.牛膝对人软骨细胞体外增殖的影响[J].中医药导报,2019,25(03):42-45.[12]ZhengWenwei,LinPingdong,MaYuhuan,ShaoXiang,ChenHouhuang,ChenDa,LiuXianxiang,LiXihai,YeHongzhi.PsoralenpromotestheexpressionofcyclinD1inchondrocytesviatheWnt/β-catenin