单细胞测序样本制备技师考试试卷及答案

单细胞测序样本制备技师考试试卷及答案一、填空题（每题1分，共10分）1.单细胞测序样本制备中，分离单个细胞常用的方法有______、______和微流控法等。2.细胞悬液制备时，需去除细胞团块的常用过滤装置是______μm细胞筛。3.单细胞文库构建中，用于逆转录的酶通常具有______活性，以避免RNA降解。4.样本制备中，评估细胞活性的常用染色剂是______（活细胞染色）和______（死细胞染色）。5.10xGenomics平台中，用于捕获单个细胞的是______珠。6.单细胞RNA-seq样本制备时，需避免RNAase污染，常用的去RNAase试剂是______。7.分离外周血单个核细胞（PBMC）常用的密度梯度离心试剂是______。8.单细胞样本制备后，需检测细胞浓度，常用仪器是______。9.文库构建中，用于PCR扩增的酶需具有______活性，以提高扩增效率和特异性。10.样本制备中，若细胞活性低于______%，需重新处理样本。二、单项选择题（每题2分，共20分）1.以下哪种方法不适合分离贴壁细胞？A.胰酶消化法B.胶原酶消化法C.机械刮除法D.密度梯度离心法2.10xGenomics单细胞平台中，GEM形成的关键是？A.细胞与凝胶珠的混合比例B.微流控芯片的流速C.油相的黏度D.以上都是3.评估单细胞悬液质量的核心指标不包括？A.细胞浓度B.细胞活性C.细胞大小D.细胞纯度4.以下哪种试剂会导致RNA降解？A.DEPC处理水B.无RNAase酶的PBSC.含RNAase的缓冲液D.无DNAase的缓冲液5.分离脑组织单细胞时，常用的解离酶组合是？A.胰酶+EDTAB.木瓜蛋白酶+DNaseIC.胶原酶I+胶原酶IID.胃蛋白酶+EDTA6.单细胞文库构建中，cDNA合成后需进行的步骤是？A.片段化B.加A尾C.连接接头D.以上都是7.以下哪种样本制备后需立即进行测序？A.新鲜细胞悬液B.冻存细胞悬液C.固定细胞D.石蜡包埋细胞8.10xGenomics平台中，每个GEM包含的细胞数通常是？A.0-1个B.1-2个C.2-3个D.3-4个9.检测细胞活性时，台盼蓝染色阳性表示细胞是？A.活细胞B.死细胞C.凋亡细胞D.坏死细胞10.以下哪种方法可提高单细胞捕获效率？A.增加细胞浓度B.减少细胞团块C.降低油相温度D.增加凝胶珠浓度三、多项选择题（每题2分，共20分）1.单细胞测序样本制备的关键步骤包括？A.样本解离B.细胞悬液制备C.单细胞捕获D.文库构建2.以下哪些属于单细胞捕获方法？A.微流控法B.激光捕获显微切割（LCM）C.流式分选D.磁珠分选3.评估细胞悬液质量的指标有？A.细胞活性≥80%B.细胞浓度在10^5-10^6cells/mLC.无明显细胞团块D.细胞大小均一4.样本解离时需注意的事项包括？A.控制解离时间B.避免过度消化C.保持低温（4℃）D.及时终止酶反应5.以下哪些试剂用于RNA保护？A.RNAlaterB.TrizolC.DEPCD.乙醇6.10xGenomics单细胞文库构建的步骤包括？A.GEM形成B.逆转录C.cDNA扩增D.文库纯化7.以下哪些样本适合单细胞测序？A.新鲜肿瘤组织B.冻存PBMCC.固定的胚胎细胞D.石蜡包埋的血液样本8.细胞计数时常用的方法有？A.血细胞计数板计数B.自动细胞计数仪计数C.流式细胞术计数D.分光光度计计数9.以下哪些会影响单细胞捕获效率？A.细胞团块数量B.细胞活性C.微流控芯片堵塞D.凝胶珠质量10.文库构建中常用的接头类型有？A.通用接头B.特异性接头C.索引接头D.随机接头四、判断题（每题2分，共20分）1.酶解法解离细胞时，胰酶可用于所有组织类型。（）2.细胞悬液制备后需立即进行过滤，去除细胞团块。（）3.10xGenomics平台中，GEM形成后需立即进行逆转录。（）4.冻存细胞悬液可直接用于单细胞捕获。（）5.台盼蓝染色时，活细胞会被染成蓝色。（）6.密度梯度离心法可用于分离PBMC和肿瘤细胞。（）7.文库构建中，PCR扩增后需进行磁珠纯化。（）8.单细胞测序样本制备中，无需考虑DNA污染。（）9.激光捕获显微切割（LCM）可用于分离特定组织区域的单细胞。（）10.细胞活性低于70%时，样本仍可用于单细胞测序。（）五、简答题（每题5分，共20分）1.简述单细胞测序样本制备中样本解离的基本原则。2.如何评估单细胞悬液的质量？3.简述10xGenomics单细胞平台中GEM形成的过程。4.样本制备中如何避免RNAase污染？六、讨论题（每题5分，共10分）1.讨论不同组织类型（如肿瘤组织、脑组织、外周血）单细胞样本制备的差异及注意事项。2.讨论单细胞测序样本制备中细胞活性低的常见原因及解决方法。---答案部分一、填空题答案1.酶解法；机械法2.403.RNaseH4.台盼蓝；伊红5.GEM（凝胶珠-微珠复合物）6.DEPC7.Ficoll-Paque8.血细胞计数板（或细胞计数仪）9.热启动DNA聚合酶10.80二、单项选择题答案1.D2.D3.C4.C5.B6.D7.A8.A9.B10.B三、多项选择题答案1.ABCD2.ABC3.ABC4.ABD5.ABD6.ABCD7.ABC8.ABC9.ABCD10.AC四、判断题答案1.×2.√3.√4.×5.×6.√7.√8.×9.√10.×五、简答题答案1.样本解离原则：①适配酶选择（贴壁用胰酶/胶原酶，脑组织用木瓜蛋白酶+DNaseI）；②控制条件（37℃/室温，10-30min），及时用含血清缓冲液终止；③轻柔机械辅助（吹打/研磨），防细胞损伤；④解离后立即40μm过滤除团块；⑤部分样本保持低温，减少RNA降解。核心平衡解离效率与细胞活性。2.悬液质量评估：①活性：台盼蓝染色，活细胞≥80%；②浓度：计数板/自动仪检测，10^5-10^6cells/mL；③纯度：无明显团块、杂质（红细胞/碎片）；④完整性：RNA完整性（RIN≥7）。若不达标需重新制备。3.GEM形成过程：①准备适配浓度单细胞悬液；②混合细胞、凝胶珠（含条形码引物）、酶mix；③微流控芯片乳化形成油包水微滴；④单包（每微滴通常1细胞+1凝胶珠）；⑤凝胶化稳定结构，引物结合RNA。控流速/比例提高单包率。4.防RNAase污染：①环境：RNAase-free超净台，DEPC擦拭；②试剂：DEPC处理水/无RNAase试剂，选RNaseH+逆转录酶；③操作：戴无RNAase手套，用一次性耗材；④样本：新鲜用RNAlater保护，快速处理。六、讨论题答案1.不同组织制备差异：①肿瘤：剪碎后胶原酶+DNaseI解离，除红细胞，控消化时间；②脑组织：木瓜蛋白酶+DNaseI温和解离，防研磨损伤，除髓鞘碎片；③外周血：Ficoll离心分离PBMC，防溶血。注意：肿瘤需评估纯度，脑组织保持低温，外周血控浓度。2.细胞活性低的原因