生物化工-遗传物质基础与基因工程

Chapter4遗传的分子基础与基因工程遗传和变异的物质基础Physicsfoundation

ofHeredityandVariation基因的表达ExpressionFunctionofGene基因的重组过程GeneralProcessofReunitingDNATechnique基因工程的应用ApplicationofGeneEngineering克隆CloneTechnology一、遗传物质的确定二、脱氧核糖核酸DNA的化学组成三、DNA的双螺旋结构四、DNA复制第一节遗传变异的物质基础

(Physicsfoundationofheredityandvariation)遗传（heredity）：亲代把其自身性状传给子代的特性变异（varation）：子代具有改变亲代遗传性状的特性核酸核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）1869年Miescher从细胞核中分离出核素（nuclein）。1889年Altman制备了核酸（nucleicacid）。1930~40年，Kossel&Levene等确定核酸的组分：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）“四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性。一、遗传物质的确定肺炎链球菌转化实验噬菌体感染实验20世纪40年代末，Avery的“肺炎双球菌转化”实验证明DNA是有机体的遗传物质：DNA无荚膜，不致病R型温育有荚膜，致病S型传代传代光滑有荚膜，S型致病有荚膜，致病有荚膜，致病噬菌体感染实验结论：除少数病毒（RNA病毒，如天花病毒和流感病毒）以RNA作为遗传物质外，多数有机体的遗传物质是DNA。不同有机体遗传物质（信息分子）的结构差别，使得其所含蛋白质（表现分子）的种类和数量有所差别，有机体表现出不同的形态结构和代谢类型。RNA的主要作用是从DNA转录遗传信息，并指导蛋白质的合成。二、脱氧核糖核酸DNA的化学组成核糖核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase

或嘧啶碱pyrimidinebase（碱基base）核糖ribose

或脱氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物Δ脱氧核糖+H+

Δω-羟基-γ-酮戊醛二苯胺蓝色产物RNA和DNA定性、定量测定（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）HHH嘧啶123456NNHHHH胞嘧啶Cytosine（C）尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHNNHNH2OHNNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPOPO--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用：ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成OHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHOHAO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA三、DNA的结构（一）DNA的一级结构因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（basesequence)。通常碱基序列由DNA链的5′→3′方向写。DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。（二）DNA的双螺旋结构1953年，Watson

和Crick

提出。1.双螺旋结构的主要依据（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。（2）Chargaff发现DNA中A与T、C与G的数目相等。后Pauling和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。2.双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）两股链之间的距离为2nm，A与T、G与C配对，分别形成2和3个氢键。（3）磷酸与核糖以3’,5’－磷酸二酯键连接，构成DNA的主链骨架，主链位于螺旋的外侧，碱基位于内侧。（4）每个碱基对的两个碱基处于同一平面，此平面与螺旋中心轴垂直。3.双螺旋结构的稳定因素（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（basestackingforce），由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。DNA双螺旋结构模型建立的意义

是DNA复制、RNA转录和反向转录的分子基础，关系到遗传信息的表达，分子生物学的开端。（三）DNA的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)→超螺旋、四、DNA复制DNA是遗传信息的载体，必须准确地进行自我复制，复制出与亲代DNA分子核苷酸顺序完全相同的子代DNA分子，并传递到子代细胞中去。解链酶，DNA聚合酶，半保留复制遗传的功能单位：基因第二节、基因的表达功能

(ExpressionFunctionsofGene)基本生命物质：核酸(nucleicacid)

蛋白质(protein)蛋白质的功能：新陈代谢及作为细胞结构的组成物质，生命活动的体现者。核酸的生物功能：存储和传递遗传信息，指导和控制蛋白质的合成。遗传信息的传递：DNA的复制和基因表达（geneexpression）基因表达：遗传物质把遗传信息转变为特定氨基酸排列顺序的蛋白质，从而决定生物体表型的过程。包括RNA的转录和蛋白质的生物合成。一、RNA的转录RNA（ribonucbicacid）:核糖核酸，由数十上百个核苷酸组成的一条单链，其特性也决定于核苷酸的（碱基）的排列顺序。——RNA分子是含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。核糖代替了脱氧核糖尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T）遗传信息的中心法则：生物的遗传信息是从DNA流向RNA,再由RNA流向蛋白质，描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的过程。DNARNAProteinTranscriptionTranslationRNA的转录过程：RNA聚合酶（转录酶）编码链（具有转录活性）转录产物：三种RNAmRNA（messengerRNA,信使RNA蛋白质合成的模板）rRNA（ribosomalRNA,核蛋白体RNA蛋白质合成的装配机）tRNA（transferRNA,转移RNA，氨基酸分子的搬运工）二、蛋白质的生物合成（一）遗传密码（二）蛋白质的生物合成（一）遗传密码及其基本特点

遗传密码：三个核苷酸作为一个密码来编码一种氨基酸，三连体密码（tripletcode）。遗传密码表遗传密码的基本特点：通用性简并性读码的连续性通用性（Universal）从病毒直到人类，细胞核DNA指导的蛋白质合成都使用同一套遗传密码。简并性（Degeneracy）

遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。这称为遗传密码的简并性。

编码同一氨基酸的几组简并密码子上第一二位碱基多相同，而第三位碱基改变往往不影响氨基酸翻译。

读码的连续性（Commaless

）（二）蛋白质的生物合成按照细胞核中DNA的指令，以mRNA为模板、tRNA为工具，在rRNA内把细胞质中的氨基酸有顺序的排列起来的过程即为蛋白质的生物合成，遗传学又叫转议或者翻译。(三)基因突变基因突变：自然突变和诱发突变一切生物的变异和进化都可以说是由于DNA的结构改变而引起蛋白质改变的结果。生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变，有的由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；有的由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸，或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。还有一些生物的遗传性状发生了突变。第三节DNA重组技术的基本过程(generalprocessofreunitingDNAtechnology)DNA重组技术是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称基因重组。基因克隆将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。基因工程的基本内容:

基因工程又叫做基因拼接技术或重组DNA技术。这种技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。

基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物FormingRecombinantDNA

DesiredGeneDNAfromtargetorganismRecombinantDNAwithgeneofinterest基因操作的工具:基因的剪刀——限制性内切酶（一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子）

基因的针线——DNA连接酶

基因的运输工具——运载体（如质粒、噬菌体和动植物病毒等）

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线DNA重组基本程序包括下列过程分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定

(目的基因能表达的受体细胞挑选出来)

表—重组基因控制蛋白质的合成1.目的基因的制取切酶切方法:内切酶人工化学合成方法

mRNA为模板的反转录法2.基因载体DNA的选择功能：

为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体……种类：磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶3.DNA体外重组(目的基因与载体的连接)接4.DNA

重组体导入受体细胞(重组体的转化)受体细胞转CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌5.外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coli）受体细胞表第四节基因工程(菌)的应用基因工程与医药卫生生产基因工程药品用于基因诊断与基因治疗基因工程与农牧业、食品工业和化学工业培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种为人类开辟新的食物来源基因工程与环境保护用于环境监测用于被污染环境的净化1、基因工程的药物生产

微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。如利用大肠杆菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素等。既增加产量，又降低成本。基因工程与医药卫生基因工程与医药卫生2、基因诊断基因诊断是用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。生物芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。

3、基因治疗(GeneTherapy)

可能治疗的疾病:Diabetes：糖尿病cardiovasculardisease：心血管疾病cysticfibrosis：囊性纤维化Alzheimer‘s：老年痴呆Parkinson’s：帕金森andmanyotherdiseasesispossible：其它一些可以治疗的疾病基因工程与医药卫生基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。基因工程与农牧业、食品工业

TheDNAofplantsandanimalscanalsobealteredPLANTSdisease-resistantandinsect-resistantcrops2.Hardierfruit3.70-75%offoodinsupermarketis

geneticallymodified.HowtoCreateaGenetically

ModifiedPlant1.Createrecombinantbacteriawithdesiredgene.2.Allowthebacteriato“infect"theplantcells.3.Desiredgeneisinsertedintoplantchromosomes.基因工程与农牧业、食品工业生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)基因工程与农牧业、食品工业转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄例：基因工程培育抗虫棉的简要过程苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接棉花植株导入基因工程与农牧业、食品工业GoldenRice

黄金大米是一种转基因大米，它通过转基因技术将胡萝卜素转化酶系统转入到大米胚乳中而获得，外表为金黄色，故称黄金大米。

alleviatingvitaminAdeficienciesinthedietsofdisadvantagedpeopleindevelopingcountries.(traditionalricevarietiesdonotproduceprovitamin-A).

基因工程与环境保护1、环境监测基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。2、环境污染治理基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。Geneticallymodifiedorganismsarecalledtransgenicorganisms.TRANSGENICANIMALSMice–usedtostudyhumanimmunesystemChickens–moreresistanttoinfectionsCows–increasemilksupplyandleanermeat

4.Goats,sheepandpigs–producehumanproteinsintheirmilkDesiredDNAisaddedtoaneggcell.HowtoCreatea

TransgenicAnimal

HumanDNAinaGoatCellThisgoatcontainsahumangenethatcodesforabloodclottingagent.Thebloodclottingagentcanbeharvestedinthegoat’smilk..TransgenicGoatWecannowgrownewbodypartsandsoondonatingbloodwillbeathingofthepast,butwillwegotoofar?Photoofamousegrowinga"humanear"

Growthhormoneandtherapycontrolsseveralcomplexphysiologicprocesses,includinggrowthandmetabolism.Twobabymice-sameageHumanGrowthhormonegeneinsertedintotheembryoofthemouseontherightcausingrapidgrowthThemouseontheleftisanormalsizedmouseGreenFluorescentProtein(GFP)andmiceGeneticEngineeringGeneticEngineerscanaltertheDNAcodeoflivingorganisms.SelectiveBreedingRecombinantDNAPCRGelElectrophoresisTransgenicOrganismsPolymeraseChainReaction

PCR基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点，在标准反应中采用三温度点法：变性：双链DNA在90～95℃变性；退火：再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上；延伸：然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。循环次数:25-30cycles。PCR扩增过程TemplateDNA变性退火延伸复制过程聚合酶链式反应是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K．B．Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过烦琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。凝胶电泳（GelElectrophoresis）Thistechnologyallowsscientiststoidentifysomeone’sDNA!StepsInvolvedinGelElectrophoresis凝胶电泳的基本原理：1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；因此，在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。影响迁移率的内在因素：①所带静电荷的多少——迁移率与表面电荷成正比。②大小和形状——直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快。③DNA构象——一般迁移速率：超螺旋环状>线状DNA>单链开环。琼脂糖凝胶的检测灵敏度在0.2～50Kb之间;聚丙烯酰胺的检测灵敏度在1～1000bp之间实验材料：

PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等；实验试剂：电泳缓冲液：TAE-乙酸盐缓冲液；TBE-硼酸盐缓冲液；TPE-磷酸盐缓冲液；

电泳载样缓冲液：

loadingbuffer（①指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；②里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔）；

电泳染料：溴化乙锭（EB），Goldview

。

凝胶电泳槽实验仪器：凝胶成像系统1、有些转基因食物含的一些物质，可能会影响人体健康。2、大量的转基因生物进入自然界后很可能会与野生物种进行杂交，产生一些超级生物，从而造成基因污染。3、如有些作物插入抗虫基因，杀死环境中有益的生物。基因工程的弊端

克隆，是Clone的译音，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。“克隆”一词于1903年被引入园艺学，以后逐渐应用于植物学、动物学和医学等方面。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。

科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。第五节克隆技术（Clonetechnology）一克隆的定义二克隆方面取得的成果

(国内外克隆研究概况)1968年，英国科学家克隆非洲爪蟾。1978年，我国科学家克隆黑斑蛙。1979年，中国科学家克隆鲫鱼，此后克隆出新鱼卵---鲤鲫鱼。1998年到1999年，美国和瑞士科学家成功克隆了灰鼠。1996年7月，克隆羊多利诞生。我国克隆技术处于世界领先位置,从1990年以来克隆出多种哺乳动物,胚胎细胞移植技术.意大利一位妇科医生声称已克隆出一名女婴,受到各国科学家的批评.三胚胎细胞克隆与体细胞克隆

1.胚胎细胞克隆：2.体细胞克隆：从成年动物身体上取一点组织，分离出一个个细胞，将细胞核移植到去核的卵子内构成克隆胚胎，然后再将其移植到动物受体内妊娠产子。分离出一个胚胎细胞，将细胞核移植到去核的卵子内，然后再将其移植到动物受体内妊娠产子。体细胞克隆“多莉”的过程先与此同时手术完成之后然后到1996年7月多利是在1996年7月5日由羅斯林研究所的伊恩·威爾穆特教授等人通過體細胞克隆法培育問世，是世界上首只成年體細胞克隆動物。伊恩·威爾穆特教授對多利的死亡表示『感到十分失望』。他說，他在大約一年前已經發現多利羊的左後腿患上了關節炎，而這種典型的『高齡病癥』對當時還年輕的多利而言，很可能意味著目前的克隆技術尚不完善。據了解，綿羊的年齡一般為11或12歲，所以科學家現在面臨的問題是：為什麼多利在6歲就患上了這種老年疾病。