2026届新高考生物考前热点复习：基因工程热点技术

2026届新高考生物考前热点复习

基因工程热点技术一、PCR技术的热点考法归纳1.RT-PCR例1逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。下列关于RT-PCR的叙述,正确的是 (

)A.RT-PCR所用的酶包括逆转录酶和TaqDNA聚合酶B.RT-PCR所用的两种引物序列不同,两者间可互补配对C.RT-PCR反应过程中需要解旋酶解旋D.正常情况下至少经过3次循环,方可获取与目的基因等长的DNA单链A2.实时定量PCR（quantitativereal-timePCR，qRQ-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。原理：它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。分类：qRT-PCR所使用的荧光化学方法主要有4种，分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法和荧光引物法。（1）DNA结合染料法。常用染料有SYBRGreenⅠ和PicoGreen。SYBRGreenⅠ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。（2）水解探针法。TaqMan探针是应用最广的水解探针，其原理主要是在PCR反应体系加入一个特异的荧光标记探针，当探针保持完整时，3′端淬灭基团抵消了5′端发射基团的荧光发射，这时检测不到荧光信号。。在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，在延伸期Taq酶作用使引物沿DNA模板延伸到达探针处，由于Taq酶具有5′→3′外切活性，使5′端标记荧光发射基团R（6-羧基荧光素）与3′端标记荧光淬灭基团Q（6-羧基四甲基罗丹明）分离，荧光信号得到释放，这时荧光探测系统就能检测到光密度的增加（3）杂交探针法。分子信标（molecularbeacon）是一段茎-环结构（stem-loopstructure）的单链DNA分子，环部为15～35bp，能与靶DNA序列互补；茎部约8bp，由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成。分子信标探针的5′端与3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时，发夹结构的2个末端靠近使荧光发射基团与荧光淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭。当有靶序列存在时，分子信标与靶序列杂交结合，使分子信标的茎部区域被拉开，3′端与5′端分离，此时荧光基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光（4）荧光引物法。LUX荧光探针（lightuponextension）技术在PCR中一条引物的3′端标记荧光基团，该引物内部含有互补序列，自身可形成能淬灭荧光的茎-环结构。在PCR延伸阶段，引物可以展开茎-环结构，与目的序列结合释放荧光，使荧光信号显著增加，该探针产生的荧光属于积累荧光，通过实时监测荧光信号的变化就可以检测样品中的目的DNA序列2.荧光定量PCR例1荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量,其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是 (

)A.引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关C.耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端D.若用上述技术检测某基因的转录水平,则需要用到逆转录酶B[解析]引物与探针均具有特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则,A正确;模板DNA含量越高,PCR扩增过程中形成的荧光分子越多,因此荧光强度越大,即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关,B错误;耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5'端到3'端,C正确;若要用荧光定量PCR技术检测某基因的转录水平,即检测细胞中mRNA的含量,则先要将mRNA逆转录形成DNA再检测,故需要用到逆转录酶,D正确。2.反向PCR传统PCR只扩增2个引物之间的已知序列，而反向PCR（inversePCR）可以对一个已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究，又称染色体步移（chromosomewalking），其核心是扩增2个引物外侧的未知序列（图2-26）。3.反向PCR测定未知DNA区域例3如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):请据图回答问题:(1)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是

(从引物①②③④中选择,填编号)。

②④

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'[解析](1)PCR引物是一小段单链核苷酸序列,引物5'端的碱基可以与DNA模板链的3'端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制的起始点,子链的延伸方向为5'→3',据题图分析,结合片段F的已知序列可知,能与已知序列左边配对的引物为④,能与已知序列右边配对的引物为②,故步骤Ⅲ选用的PCR引物应为②④。PCR引物设计原则

两种引物是对向的，目的基因在中间；两种引物都结合在DNA模板链的_____端，子链延伸时沿着引物向__

端延伸；引物自身不应存在互补序列两条引物之间不应存在互补序列引物越长，G+C比例越高，退火温度越高引物的长度一般在18~25b（base碱基），太短则特异性不够强，太长则退火温度会比较高。两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。⑥需在两种引物的5’端加上启动子（或终止子）序列和限制酶的酶识别序列3’3’思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（等长的DNA片段）？思考：1个DNA循环n次后产生目的基因多少个？2n-2n扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量22046814262n2n+1-22n-21372n-1利用PCR技术获取目的基因，请画出扩增2次的结果？扩增次数第1次第2次第3次第n次长单链总数中单链总数短单链总数等长DNA总数22222462n0282n+1-2-2n0022n-2n3.不对称PCR

PCR的扩增是双链DNA的2条链，而DNA序列分析只需要其中1条链即可，因此有人设计了不对称PCR（asymmetricPCR）用于产生单链DNA。4.重叠PCR技术例4[2023·辽宁大连一模]“多发性骨性连接综合征”是由编码成纤维细胞生长因子(FGF9)的基因突变所致,患者FGF9基因中某碱基对发生替换,使FGF9中相应的氨基酸发生替换。科研人员欲利用基因工程等技术获得含有该突变基因的模型小鼠,用来研究该病的发病机理。图甲表示将FGF9cDNA(由FGF9基因转录得到的mRNA逆转录而来)进行定点突变得到突变型FGF9cDNA的流程,图乙为研究中所用的质粒(SpeⅠ、HindⅢ、SmaⅠ和BglⅡ分别代表相应的限制酶切割位点,以上限制酶切割产生的黏性末端不同)。请回答下列问题:(1)图甲虚线方框中的a链与d链在延伸过程中的作用是既可作为

又可以起到相当于

的作用,使

酶能够从a链与d链的3'端开始连接脱氧核苷酸。

模板引物耐高温的DNA聚合[解析](1)由题图分析可知:图甲虚线方框中的a链与d链在延伸过程中的作用是既可作为模板,又可以起到相当于引物的作用,使耐高温的DNA聚合酶能够从a链与d链的3'端开始连接脱氧核苷酸。(2)图乙质粒中的C序列是

,它是RNA聚合酶识别和结合的部位。图甲中突变型FGF9cDNA的a链所在的DNA单链为转录的模板链,则引物1和引物4的5'端需分别添加

(酶)的识别序列,才能与图乙中的质粒正确连接。

启动子HindⅢ和SpeⅠ[解析](2)图乙质粒中的C序列是启动子,位于目的基因的上游,紧挨转录的起始位点,是RNA聚合酶识别和结合的部位。图甲中突变型FGF9cDNA的a链所在的DNA单链为转录的模板链,为了保证目的基因在启动子和终止子之间且质粒上需要保留启动子、终止子、复制原点和至少一个标记基因,使用双酶切可以避免载体自身环化,因此选用HindⅢ和SpeⅠ切割质粒,为了便于目的基因和质粒连接,需要用相同的酶切割目的基因,以产生相同的黏性末端,所以引物1和引物4的5'端需分别添加HindⅢ和SpeⅠ的识别序列,才能与图乙中的质粒正确连接。4.锚定PCR锚定PCR（anchoredPCR，A-PCR）常用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。6.巢式PCR例6为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们对普通PCR技术进行了改良,发明了巢式PCR技术,其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15~30次循环),第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部,经过15~30次循环,获得第二轮扩增片段(即目的基因),最终第二轮扩增片段短于第一轮,基本过程如图所示。下列叙述错误的是 (

)A.两对引物的碱基序列不相同,但均应为单链DNA片段B.使用外引物至少经过3次循环,才能得到图示的第一轮扩增产物C.若第一轮扩增产生错误片段,则其进入第二轮扩增的概率极低D.与巢式PCR相比,普通PCR特异性更强,错误率更高√[解析]两对引物的碱基序列不相同,但均应为单链DNA片段,以便与模板互补配对,A正确;根据DNA的半保留复制的特点,可知PCR前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即仅含引物之间的序列,因此,至少经过3次循环才能得到图示的第一轮扩增产物,B正确;由于内引物扩增模板是外引物扩增后的产物,第二轮反应能否进行,也是对第一轮反应正确性的鉴定,如果第一轮扩增产生了错误片段,则第二轮能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,C正确;巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,都含有模板、引物、热稳定的DNA聚合酶、四种游离的脱氧核苷酸、缓冲液、Mg2+等,第一轮扩增中,外引物用以产生扩增产物,此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增,从而提高反应的特异性,获得的产物特异性更强,D错误。6.RACE-PCR

cDNA末端快速扩增技术（rapidamplificationofcDNAends，RACE）是由Frohman等于1988年发明的一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′端的有效方法，其以简单、快速、廉价等优势而受到普遍重视，在扩增全长cDNA方面得到了广泛应用。原理：通过以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，采用PCR方法实现从基因内部某个特定位点到3′或5′端之间未知序列的克隆，有3′-RACE和5′-RACE之分。3′-RACE技术先用杂合引物（QT）进行反转录合成cDNA第一链，QT由oligo（dT）及特定的寡核苷酸序列（Q1-Q0）构成，然后以Q0和基因特异性引物（GSP1）进行首次PCR扩增，再以Q1和基因特异性引物（GSP2）为巢穴引物进行嵌套式PCR扩增，最后获得基因3′端片段（图2-30）。5′-RACE首先用基因特异性引物（GSP-RT）反转录产生cDNA第一链，再用末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA第一链3′端加入polyA。然后，用杂合引物（QT）和基因特异性引物（GSP1）进行首次PCR扩增，再以Q1与GSP2进行二次扩增，最后获得基因5′端片段（图2-31）。7.大引物PCR也是一种PCR定点突变技术，该技术需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程（如图所示）。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。IKK激酶由IKKα、IKKβ、IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKBβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如下图所示，分析回答：

习题精练（1）在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）引物B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶Hind

Ⅲ识别序列）引物C：5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）则PCR1中使用的引物有__________________，PCR2中使用的引物有_____________和图中大引物的_______（①/②）链。（2）在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入

等。PCR中尽可能提高退火温度以减少

。引物A和引物C引物B②Taq聚合酶、4种脱氧核苷酸非目标基因的获得

习题精练(4)科学家运用大引物PCR定点突变技术对胰岛素第28位氨基酸实现了替换，获得了速效胰岛素类似物产品。相关原理如图所示：①第一次PCR至少需要

个循环才能获得相应的大引物模板，第二次PCR应选用大引物两条链中的

（填“A”或“B”），若第二次PCR计划循环n次，至少需要大引物

个。习题精练2B2n-1PCR技术的应用1.D