微生物的基本培养技术（第二课时）高二下学期生物人教版选择性必修3

第一章发酵工程第2节

微生物的培养技术及应用人教版·选择性必修3问题探究由单一个体繁殖所获得的微生物群体。如何从自然界中分离出需要的特定微生物？

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？纯培养配制培养基灭菌接种分离培养纯培养物

这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。美国黄石公园耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家布鲁克从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Taq细菌），进而提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。问题探究讨论：1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？启示：寻找目的菌种时要根据它对

的要求，到相应的环境中去寻找。一、选择培养基生存环境1.在被石油污染的土壤中可以筛选

微生物。2.在冰川冻土层可以筛选

微生物。3.以纤维素为唯一碳源培养基

。分解石油耐寒纤维素分解菌热泉冰川石油落叶实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基应运而生。（1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。（2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。一、选择培养基（1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。（2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。不加碳源的培养基分离出自养微生物分离耐热菌70～80℃的高温不加氮源的培养基分离固氮微生物加青霉素的培养基分离真菌加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌一、选择培养基加石油为唯一碳源分离出分解石油的分解菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)（3）实例：（1）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。（2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。不加碳源的培养基分离出自养微生物分离耐热菌70～80℃的高温不加氮源的培养基分离固氮微生物加青霉素的培养基分离真菌加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌一、选择培养基加石油为唯一碳源分离出分解石油的分解菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)（3）实例：教材帮P28解题通法选择培养基培养基中加氨苄青霉素怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌？没有氨苄青霉素抗性的细菌能够生长具有抗氨苄青霉素能力的细菌没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰一、选择培养基培养基+氨苄青霉素培养基问题：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？思考讨论：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？一、选择培养基

应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。基础培养基选择培养基

问题：如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？P16记CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3怎样才能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来？

尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。一、选择培养基思考·讨论：选择培养基配方的设计

设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？

尿素芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。尿素的立体结构P16思考讨论1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是

；该类培养基的主要用途为

。2.从用途上来讲，

属于选择培养基，目的是为了获得

。3.两种培养基共有的培养基成分有：

。培养基一的主要碳源为

，主要氮源为

；培养基二的碳源为

，氮源为

。固体添加了凝固剂琼脂分离、鉴定、计数、保存培养基二能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素巩固练习牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一培养基二二、微生物的选择培养选择培养基+稀释涂布平板单菌落稀释涂布平板法：

将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，需要解决哪2个问题？选择培养：获得能分解尿素的细菌的纯培养物。计数：土壤菌液进行充分稀释及科学的微生物数量测定方法—稀释涂布平板法。P17二、微生物的选择培养第1步：取样并稀释10倍10g90mL的无菌水

2、稀释涂布平板操作过程铲取土样，将样品装入纸袋中。1将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。23取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1◊101mL1mL1mL1mL1mL1mL1◊1031◊1041◊1051◊1061◊1071◊1029mL无菌水第2步：系列梯度稀释取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。二、微生物的选择培养第3步：涂布平板5将涂布器浸入在盛有酒精的烧杯中取0.1mL菌液，滴加到培养基表面4用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。7将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。6取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽。涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

2、稀释涂布平板操作过程二、微生物的选择培养待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。恒温培养箱空白对照稀释104倍稀释105倍稀释106倍注意事项：涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底/是否被污染。

3、微生物培养三、微生物的数量测定原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。原则一般选择菌落数（稳定）在

的平板进行计数。同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。缺点统计的菌落数往往比活菌的实际数目

。

因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用

而不用活菌数来表示。减少实验误差，保证实验结果更准确30~300低菌落数

4、稀释涂布平板计数法计数（间接计数）恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。思考：平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？二、微生物的选择培养不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。M代表稀释倍数；C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M×

稀释倍数；培养基上平均菌落数涂布液的体积(mL)

每毫升（每克）原液含菌数＝计算公式

4、稀释涂布平板计数法计数（间接计数）思考：平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？二、微生物的选择培养不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。M代表稀释倍数；C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M×

稀释倍数；培养基上平均菌落数涂布液的体积(mL)

每毫升（每克）原液含菌数＝例题1：某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B计算公式

4、稀释涂布平板计数法计数（间接计数）三、微生物的数量测定原理利用特定的

或

，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。细菌计数板血细胞计数板较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。细菌计数板血细胞计数板优点快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。①不能区分死菌和活菌，统计结果会偏大②不适于运动的和个体小的细菌缺点也可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。

5、显微镜直接计数（直接计数）二、微生物的选择培养每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数计数区放大后的计数室计数方法

5、显微镜直接计数（直接计数）二、微生物的选择培养内容直接计数法（显微镜直接计数法）间接计数法（稀释涂布平板法）主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点快速直观、计数方便、操作简单计数的是活菌缺点不能区分死菌与活菌操作较复杂且有一定误差计算公式每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每毫升原液含菌株数＝

平均菌落数

所用涂布液体积微生物的计数方法比较×稀释倍数二、微生物的选择培养平板划线法与稀释涂布平板法的比较方法平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途效果图相同点连续划线梯度稀释→涂布平板接种环涂布器从最后划线区挑取稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行

细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意（1）土壤取样三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数3.实验设计：①选择培养基：以尿素为唯一氮源。②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。（2）制备培养基葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml（3）样品的稀释与稀释涂布平板法接种三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。预实验实验组对照组思考如何验证培养基中是否含有杂菌？三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数组别具体组别具体操作作用实验组实验组1涂布接种的选择培养基三次重复排除偶然因素对实验结果的影响，用以分离并计数能分解尿素的细菌。实验组2涂布接种的选择培养基实验组3涂布接种的选择培养基对照组4涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基对照组4与实验组1、2、3组对比用以验证选择培养基是否具有选择作用。对照组对照组1不涂布接种的选择培养基对照组1与实验组1、2、3组对比用以验证选择培养基中是否含有杂菌。对照组2不涂布接种的牛肉膏蛋白胨培养基对照组2与对照组4对比用以验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。实验结果实验组1、2、3分离得到尿素分解菌的单菌落；第4组得到多种菌落；第5、6组正常情况下无菌落。(4)微生物的培养与观察三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。稀释度104105106107123平均值123平均值123平均值123平均值菌落数/平板思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。不一定，因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖，还需要进一步的鉴定。4.进一步探究三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数资料：细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3

，NH3会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

脲酶pH升高，酚红指示剂变红在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。几种常用的鉴别培养基伊红—亚甲蓝琼脂培养基淀粉培养基尿路菌群显色培养基念珠菌群显色培养基

在培养基中加入某种指示剂或化学药品（不影响微生物正常生长），使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。鉴别培养基：伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌拓展应用大肠杆菌菌落呈现深紫色项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例结果加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长),使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红-亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈深紫色，并呈金属光泽)加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数P30右上角培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物普通培养基上所有菌种都能生长选择培养基上部分菌种才能生长目的菌周围出现特殊现象非目的菌周围无明显现象

纤维素其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如图所示）。几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈(1)筛选纤维素分解菌的方法

。该方法可以通过________反应直接筛选。(2)菌落周围

（有/没有）透明圈，说明是纤维素分解菌。纤维素分解菌的筛选刚果红染色法颜色有P20练习与应用

拓展与应用T2P20练习与应用

拓展与应用T2请回答下列问题：（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土样，装入无菌信封内密封。将样品梯度稀释。将稀释后的样品涂布到鉴别纤维素分解菌的刚果红培养基上，在培养的过程中，纤维素分解菌产生纤维素酶，将纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，而纤维素被分解后则不能与刚果红结合形成红色复合物，在培养基上就形成了以纤维素分解菌为中心的透明圈。用接种环或接种针挑选产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌的菌落。土壤取样样品稀释将样品涂布到刚果红培养基上挑选产生透明圈的菌落P20练习与应用

拓展与应用T2请回答下列问题：（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？（3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，更容易