RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的作用研究

RpoS在荧光假单胞菌致水产品腐败过程中的作用研究摘要：在食品安全方面普遍关注的是水产品腐败，在众多可能导致水产品腐败的因素中，微生物活动是最重要的。为了保证水产品的质量和安全，研究水产品腐败菌的腐败活性调控机制是十分必要的。本文的研究对象是三文鱼的特定腐败菌——荧光假单胞菌，通过对荧光假单胞菌野生型和rpoS突变株进行比较，研究RpoS对荧光假单胞菌腐败活性的调控作用。研究结果表明RpoS直接正向调控高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的合成，调节生物被膜的形成，此外三文鱼汁腐败实验结果表明RpoS调节荧光假单胞菌胞外蛋白酶的分泌和挥发性盐基氮的产生。本论文的研究结果表明RpoS是荧光假单胞菌重要的腐败作用调节因子，为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。关键词：食品腐败；荧光假单胞菌；RpoS；群体感应StudyontheroleofRpoSinspoilageofaquaticproductscausedbyPseudomonasfluorescensAbstract：Bewidelyconcernedinthefieldoffoodsafetyisspoilageofaquaticproducts.Microbialactivityisthemostimportantoneofthefactorsthatmaycausespoilageofaquaticproducts.Studyingthecontrolmechanismofspoilageactivityofspoilagebacteriaonaquaticproductsisofgreatsignificanceforensuringthequalityandsafetyofaquaticproducts.Inthispaper,thespecificspoilageorganismofsalmon,Pseudomonasfluorescens,wasusedastheresearchobject.TheregulationroleofRpoSinspoilageactivitiesofPseudomonasfluorescenswasstudiedbycomparingdifferencebetweenthewildtypestrainandtherpoSmutantstrain.TheresultsshowedthatRpoSdirectlyregulatedthesynthesisofhomoserinelactonequorumsensingmoleculesandparticipatedintheformationofbiofilms.Besides,theresultofsalmonjuiceexperimentshowedthatRpoSregulatedthesecretionofextracellularproteasesofPseudomonasfluorescensandtheproductionofvolatilebasenitrogen.TheresultsofthispaperindicatethatRpoSisanimportantregulatorofspoilageactivitiesinPseudomonasfluorescens,whichprovidesatheoreticalbasisfortargetedcontrolofbacterialspoilageandexplorationofefficientaquaticproductpreservationtechnologies.Keywords：Foodspoilage；Pseudomonasfluorescens；RpoS;Quorumsensing近年来，伴随食品卫生安全事件的发生，食品安全的问题却一直没有被很好地解决，食品腐败便是其中之一。物理、化学、生物因素以及微生物的污染等都可以引起食品腐败。但尤以在食品的贮藏、加工流通过程中的微生物活动所引起的最受关注及广泛和严重[1]，在食品腐败中受到较多关注的是水产品腐败。据统计，全球每年有25%的食品是由于收获后微生物活动造成损失的，其经济损失可多达几百亿美元，约30%的捕获鱼类的损失是由于微生物单因素的腐败作用造成的[2-3]。早从19世纪的中叶伊始，就有大量的有关捕获和贮藏流通过程中的鱼类腐败的研究在进行，进而提出了特定腐败菌（SSO）这一概念[4]，即少数腐败微生物能够适应不利的生存环境，不断繁殖成为优势菌群，同时生成具有异味的腐败气息的代谢物。假单胞菌是水产品中常见的SSO，并有研究表明在三文鱼、罗非鱼、大菱鲆和鲶鱼等的有氧冷藏过程中的SSO均为荧光假单胞菌[5-8]。荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）是假单胞菌属，有鞭毛具有运动性，产生物被膜、革兰阴性好氧或兼性厌氧杆菌，普遍存在于土壤和水生环境中的微生物，是水产品腐败的重要的冷增腐败菌。其适应温度广，正常生长温度为25-30℃，在4℃这样不利的低温环境下也能快速增殖，其腐败能力主要是由于它可以产生在受热条件下也有活性的蛋白酶和脂肪酶等代谢产物[9]，此类代谢产物促使进一步分解食品中的蛋白和脂肪成分，生成各种具有腐臭特征的醛、酮、氨（胺）、酯和有机酸等产物，改变和降低了食品的色泽及食用价值，甚至产生毒性[10]。因而研究腐败菌腐败活性的调控机制对于减少食品安全事件的发生具有重要意义，而目前尚未见关于荧光假单胞菌腐败作用的调控机制的报道。RpoS是由细菌rpoS基因编码的可协助RNA聚合酶识别启动子序列并启动下游相关基因的表达，起到调节基因转录的作用的RNA聚合酶的选择性因子，大量表达于细菌的平台期并直接调控毒力相关基因的表达，包括生物被膜、黏附因子（外膜蛋白、菌毛、胞外多糖）、胞外蛋白酶等[11]。对于水产品腐败菌而言，直接造成腐败是由于胞外蛋白酶和脂肪酶的作用，而生物被膜和黏附因子及其他代谢产物的形成可加剧腐败作用[3]。此外，细菌的群体感应（Quorumsensing）现象被认为与水产品的腐败及生物被膜的形成有密切联系，且腐败因子的产生也受到影响[12]。崔方超等[13]研究发现QS系统可调控荧光假单胞菌的生物被膜及胞外蛋白酶等腐败因子。同时，部分细菌的RpoS与群体感应信号分子的合成存在调控关系[14-15]。因而荧光假单胞菌的腐败特性很可能受RpoS的调控。本文通过分析RpoS调控荧光假单胞菌群体感应信号分子的合成和生物被膜的形成，以及对冷藏三文鱼汁的腐败作用，为靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术提供理论基础。材料与方法菌株、质粒与培养条件荧光假单胞菌UK4（购自德国菌种保存中心（DSMZ），标准菌株，基因已测序，腐败活性与从水产品中分离出来的菌株相当），荧光假单胞菌rpoS基因缺失突变株△rpoS,UK4和UK4（△rpoS）在28℃的LB或NB培养基中培养。大肠杆菌（EscherichiaColi）β2163在37℃的LB培养基中培养，紫色杆菌（Chromobacteriumviolaceum）CV026在28℃的LB培养基中培养。试剂与设备培养基：平板计数琼脂（PCA）和LB培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。主要试剂：RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自Invitrogen公司。主要设备：全自动凯氏定氮仪KJELTEC2300，丹麦FOSS公司；CFX384多重实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；SW-CJ-2FD超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；紫外可见光光度计UV-2550，日本岛津公司。信号分子检测1）报告菌株平行划线法：参考Li[16]等的方法，以紫色杆菌CV026为报告菌株，通过平行划线法检测UK4和UK4（△rpoS）产生信号分子的量，报告菌株颜色的深浅反映待测菌株信号分子生成量的多少。紫色杆菌CV026是短链C4~C8-HSL的报告菌株[13]。2）AHLs的提取及LC-MS/MS检测：提取AHLs信号分子参考綦国红等[12]的方法，分别接种荧光假单胞菌UK4和UK4（△rpoS）于50mLLB液体培养基中28℃培养24h，10000g、4℃离心10min收集上清液。混合上清液与等体积酸化乙酸乙酯（含0.1%冰醋酸），涡旋振荡，静置分层后取有机相，重复3次此操作，旋转蒸发至干，用适量甲醇溶解烧瓶内壁上的AHLs信号分子，-20℃保存备用。参考Zhao等[17]的方法通过LC-MS/MS检测AHLs的含量，采用Agilent液质联用分析仪1290infinityII-6460TripleQuad和RRHDEclipsePlusC18色谱柱（50mm×2.1mm×1.8μm）进行分析。提取的信号分子经C18色谱柱分离后进入质谱,采用电喷雾离子源正离子模式和多反应监测（MRM）模式，外标法进行定量分析，6种合成的AHL标品C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL作为混合外标定量。荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）取培养于LB液体培养基生长至对数期的UK4和△rpoS菌液10mL，7000g、5min离心收集，样品迅速用液氮冷冻，存于-80℃。样品总RNA的提取参考RneasyPlantMiniKit说明书进行，采用分光光度计测定RNA含量及纯度并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA标本的完整性。荧光定量RT-PCR参考Liu等[18]的方法进行，RNA样品通过随机引物和SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSuperMix反转录试剂盒合成cDNA，采用PowerSYBR1GreenPCRMasterMix试剂盒进行荧光定量PCR。以16SrRNA基因为内标基因，各个基因的相对表达水平以△△Ct法进行计算。5对群体感应相关基因引物和1对16S内标基因引物序列见表1。5’-cDNA末端快速扩增（5’-RACE）使用VacciniaCappingSystem和GeneRacer试剂盒进行，具体步骤参照试剂盒说明书。首先合成的用于5’-RACE的带有接头的第一条链cDNA模板，然后进行两轮PCR。用于5’-RACE的2个AHL合成酶基因的引物序列见表2。透射电镜比较野生型和突变株生物被膜的差异参考Liu等［19］的方法，先将UK4和UK4（△rpoS）接种于装有6mL的LB液体培养基中28℃培养16-22h，之后在超净工作台无菌操作将UK4和UK4（△rpoS）各取5μL菌液接种至1%蛋白胨半固体平板（1.2%琼脂）28℃培养7天，用接种环从平板上小心刮下来，转移到装有1mL2.5%戊二醛的Ep管中，4℃保存准备用于透射电镜（TEM）观察。三文鱼汁腐败实验从杭州近江水产市场购得实验所用三文鱼置于冰上，1h内运至实验室。灭菌三文鱼汁的方法参考Dalgaard等［20］：在称取并绞碎的500g三文鱼片加500mL水，均匀搅拌后煮沸，等待冷却后过滤；得到的滤液离心4200r/min、30min，取上清液；加0.1mol/L磷酸缓冲液于上清液中，调至pH为6.6。每L鱼汁中加入1.6g氧化三甲胺（trimethylamineoxide，TMAO）、40mg半胱氨酸及40mg甲硫氨酸，搅拌混合均匀后高压蒸汽灭菌121℃、15min。将过夜培养的UK4和UK4（△rpoS）按照4-5lgcfu/mL的接种量接种，对照为添加生理盐水的样品，4℃条件下贮存1、2、3、4、5和6d后取样测定菌落总数（TVC）、蛋白酶的活力及挥发性盐基氮（TVB-N）的含量。菌落数采用稀释平板计数法进行。蛋白酶活力测定参考葛阳杨等[21]的方法进行TVB-N含量测定参考Zhu等[22]的方法中半微量定氮法测定，以mg/100mL鱼汁来表示。表SEQ表\*ARABIC15对群体感应相关基因引物和1对16S内标基因引物序列。TableSEQTable\*ARABIC1Thesequencesoffivepairsofquorumsensingrelatedgeneprimersandonepairof16Sinternalstandardgeneprimer.Gene基因名称PrimerSequences(5'to3')引物序列（5'→3'）Size(bp)扩增长度Annealing(℃)溶解温度16SCCAACATCTCACGACACGAGCT14760GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAHZ99_RS01135CGCTATCGCCACGAAGTGTT14760GCAACCGCAAACCTGACCTTHZ99_RS01140CGGCTCCTACCCCGAAACAT11460GCGTCGTTCCACAGCACCATHZ99_RS22845GCGGAGGCAGTGAAATCAAAG8760CGAGCAACTCGGAGAACGTATCHZ99_RS22840CCCTGACGACTCGTGAGAAGGCGGGACGCAACACCAAACT14660HZ99_RS12825GGCTCCAATGCCATTTATCGACCAGCTCGATGTAGTGCTGTGTTT10063表SEQ表\*ARABIC2用于5’-RACE的2个AHL合成酶基因的引物序列。TableSEQTable\*ARABIC2ThesequencesoftwoAHLsynthasegenesprimerfor5’RACE.引物名称序列（5′to3′）RS01140-R1CACGGACAGTACCCGCAGCGAATGATRS01140-R2GGGCGTCGTTCCACAGCACCATCTRS22845-R1CGAGGTGTCACGGCAAATCGACTGARS22845-R2GCAACTCGGAGAACGTATCCCTGAGCAT结果与讨论RpoS调控荧光假单胞菌群体感应信号分子的合成以紫色杆菌CV026为报告菌株，通过平行划线法检测了UK4及其突变株ΔrpoS的AHLs信号分子生成量（图1）。实验结果表明，培养24小时后，野生型荧光假单胞菌UK4能够产生AHLs，从而诱导紫色杆菌CV026变成紫色，但是UK4(ΔrpoS)不能诱导紫色杆菌CV026变成紫色。培养48小时与培养24小时相比，UK4诱导紫色杆菌的颜色变深，UK4(ΔrpoS)也能够诱导紫色杆菌产生紫色，但明显比野生型诱导的颜色浅，实验结果表明rpoS基因突变导致群体感应信号分子AHLs的生成量降低。图SEQ图\*ARABIC1报告菌株平行划线法检测荧光假单胞菌野生型UK4及突变株UK4（△rpoS）AHLs群体感应信号分子。FigureSEQFigure\*ARABIC1DeterminationofAHLsinP.fluorescenswildtypeUK4andUK4(△rpoS)mutantbyreportedstrainparalledsteakmethod.利用LC-MS/MS检测了UK4及UK4（ΔrpoS）的AHL信号分子（表1）。根据保留时间和信号分子质谱检测过程中的特征性碎片，共鉴定出6种AHLs：C4-HSL(m/z172)，C6-HSL(m/z200)，C8-HSL(m/z228)，C10-HSL(m/z256)，C12-HSL(m/z284)和C14-HSL(m/z312)。其中三种长链信号分子C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL的生成量明显高于UK4，表明rpoS基因的缺失突变可导致长链信号分子的合成量升高，RpoS对于长链AHLs信号分子的合成具有调控作用。表SEQ表\*ARABIC3LC-MS/MS检测荧光假单胞菌野生型和突变株ΔrpoS群体感应信号分子AHLs。TableSEQTable\*ARABIC3DeterminationofAHLsinP.fluorescenswildtypeandΔrpoSmutantbyLC-MS/MSAHLsRetentiontimePrecursorionProductionAHLconcentration(μg/L)(min)(m/z)(m/z)WildtypeΔrpoSC4-HSL0.7817210218.012.7C6-HSL10.89200102168.4146.0C8-HSL12.32228102203.0217.2C10-HSL13.74256102811.51495.3C12-HSL15.02284102764.11211.7C14-HSL16.103121021085.22067.0通过荧光定量RT-PCR检测了5个群体感应相关基因在UK4及其突变株中的表达水平差异（图2a），这5个基因中有2个AHL合成酶基因HZ99_RS01135和HZ99_RS22845，3个LuxR-like转录调控因子基因HZ99_RS01140。其中HZ99_RS01140与HZ99_RS01135位于同一个操纵子，且HZ99_RS01140是该操纵子的第一个基因。研究结果表明在突变株中这5个基因的表达量均显著低于野生型，降低的倍数约为3-6倍。这也从基因表达水平证明了RpoS对于群体感应的正调控作用。此外，为了研究RpoS是否直接调控群体感应信号分子的合成，通过5’-RACE及测序，获取了上述2个AHL合成酶基因的转录起始位点并对启动子区序列进行了分析（图2b）。在铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）和大肠杆菌（Escherichiacoli）中，RpoS依赖的基因启动子-10区的保守序列为CTATACT，其中每个位点的核苷酸频率为C，100%；T，100%；A，56%；T,50%；A，75%；C，69%；T，100%[14，23]。本研究结果表明，在荧光假单胞菌中，这2个AHL合成酶基因启动子-10区的序列分别为CTAGATT和CTATTCT，与大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的RpoS依赖的基因启动子-10区的保守序列匹配度很高，证明荧光假单胞菌的这2个AHL合成酶基因启动子存在RpoS依赖的-10区元件。因此，RpoS很可能直接调控荧光假单胞菌的群体感应。以上结果首次揭示了荧光假单胞菌中新的控制AHL群体感应的信号通路。微生物活动是导致食品腐败的重要因素，食品腐败进程可被菌群间的相互作用以及由多种腐败菌株产生的腐败物质加速，同时也使得这个过程更为复杂。已有大量的研究表明细菌的群体感应与食品腐败间的紧密的联系。如有研究认为引起食品腐败的果胶水解酶、蛋白酶的活性与腐败菌群间相互作用及由其产生的群体感应信号分子AHLs关系密切[24]。此外，Gram等[25]的研究也表明了肉类的腐败是由假单胞菌产生的AHLs信号分子和菌群间的相互作用造成的。还有Jay等[26]研究发现了在有氧贮存下的肉制品及其表面形成的黏液中检测出了细菌的QS信号分子，并参与了腐败过程。因而，RpoS很可能通过调节群体感应从而进一步调节腐败活性。图SEQ图\*ARABIC2（a）荧光定量RT-PCR检测荧光假单胞菌野生型UK4及突变株UK4(ΔrpoS)AHLs群体感应相关基因的表达水平；（b）5’-RACE测序分析群体感应合成酶基因的RpoS依赖启动子元件FigureSEQFigure\*ARABIC2（a）DeterrminationoftheexpressionlevelofAHLsinP.fluorescenswildtypeUK4andUK4(△rpoS)mutantbyqRT-PCR；（b）AnalysisofRpoS-dependentpromoterelementsonquorumsensingsynthasegeneby5’-RACEsequencing.RpoS调控荧光假单胞菌生物被膜的形成在提供营养的半固体蛋白胨琼脂平板上形成的菌落生物被膜反映了在腐烂的有机材料（例如土壤或人类食物）上生长的生物被膜的状况。我们利用TEM观察在细胞水平上大菌落。尽管野生型和突变株的两个菌落均包含杆状细胞，但很明显，野生型细胞被包埋在形成篮样网络的细胞外基质中，而突变型细胞的细胞外基质是无序杂乱的且含量也低于野生型。这些结果表明RpoS参与了生物被膜基质的生产。图SEQ图\*ARABIC3UK4和UK4（△rpoS）大菌落生物被膜在TEM下的比较；（A，B）大菌落生物被膜在×11,500和×20,500放大倍数下的透射电子显微镜照片。细胞周围的基质材料用红色箭头标记。FigureSEQFigure\*ARABIC3ComparisonofmacrocolonybiofilmbetweenUK4andUK4（△rpoS）byTEM；（A，B）Transmissionelectronmicrographsofthemacrocolonybiofilmsat×11,500and×20,500magnification.Matrixmaterialssurroundingthecellsaremarkedwithredarrows.2.3 RpoS调控荧光假单胞菌对灭菌三文鱼汁的腐败作用三文鱼的SSO是荧光假单胞菌[5]，为了确定RpoS与荧光假单胞菌对三文鱼的腐败活性间的调控关系，分别于4℃贮存的灭菌三文鱼汁中接种了UK4和UK4（△rpoS），比较在低温贮存过程中两者的TVC、胞外蛋白酶活性和TVB-N的差异。实验结果表明，UK4和UK4（△rpoS）在贮存过程中的生长曲线几乎完全重合，生长速度无显著差异（图4a）。UK4和UK4（ΔrpoS）的胞外蛋白酶活性在前2天没有显著差异，至第3天时，UK4（ΔrpoS）的胞外蛋白酶活性开始显著低于UK4（图4b，p<0.05）。TVB-N趋势变化与胞外蛋白酶活性的趋势相似，也是从第3天开始有了显著差异，UK4（ΔrpoS）的TVB-N开始显著低于UK4（图4c，p<0.05）。胞外蛋白酶能够迅速降解蛋白质，并进一步产生TVB-N和腐败臭味，是重要的评价水产品腐败的指标。有关胞外蛋白酶，同研究的荧光假单胞菌的情况相似，RpoS也可调控铜绿假单胞菌和溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）中的胞外蛋白酶定的产生[27-28]。崔方超等[13]研究发现荧光假单胞菌的生物被膜及胞外蛋白酶等腐败因子受到QS系统的调控。有研究指出外源性群体感应信号分子AHLs的添加可加速无菌鱼汁的腐败，可导致产生更多的TVB-N，且AHLs能够影响大黄鱼中的优势腐败菌希瓦氏菌胞外蛋白酶的分泌[29]。因此，推测RpoS可能是通过群体感应来调节胞外蛋白酶以及TVB-N的生成。图SEQ图\*ARABIC4接种于灭菌三文鱼汁中荧光假单胞菌UK4及UK4（△rpoS）在4℃贮存过程中菌落总数（a）、胞外蛋白酶（b）活性、以及TVB-N（c）含量测定。数据的表示方式为平均值±标准偏差。FigureSEQFigure\*ARABIC4EffectofRpoSonTVC(A)andTVB-N(B)ofP.fluorescensinsterilizedsalmonmusclejuicestoredat4°C.Dataisexpressedasmeans±standarddeviations.总结综上所述，RpoS正向调控群体感应相关基因的表达，2个群体感应合成酶基因的启动子区含有RpoS依赖的启动子元件，证明其直接调控群体感应合成酶基因的表达。透射电镜比较野生型和突变株生物被膜的差异的结果也表明RpoS参与了生物被膜基质的形成。除此之外，RpoS调控荧光假单胞菌在冷藏三文鱼汁中的胞外蛋白酶活性以及TVB-N的产生。我们推测RpoS很可能通过群体感应来调节胞外蛋白酶及TVB-N的生成。RpoS对荧光假单胞菌致腐败的相关特性的调节证明它是一个重要的细菌腐败作用调控蛋白。本研究对于靶向控制细菌腐败作用和探索高效水产品保鲜技术具有重要意义。创新点利用5’-RACE及测序分析RpoS是否直接调控群体感应信号分子的合成。展望本研究再次表明群体感应与水产品腐败的联系密切，许多食品腐败特性如生物被膜、嗜铁素以及蛋白水解活性均涉及群体感应系统调控。后续可对这2个群体感应合成酶基因在荧光假单胞菌中所起的作用进行研究，这两个合成酶基因的缺失突变是否会对荧光假单胞菌致水产品的腐败作用或其他方面产生影响，进一步研究群体感应对荧光假单胞菌致腐的具体机制。同时关于腐败特性可再加做嗜铁素检测的相关实验。生物被膜在细菌致腐败过程中起到了重要的作用，是造成食品腐败的一个潜在的持续污染源，且一旦形成，难以彻底将其清除。本研究中有关生物被膜的实验涉及较少，仅采用了定性的方法-TEM观察生物被膜的精细结构，后续可选用一些定量方法进行检测，以通过控制生物被膜的形成为水产品保鲜提供新的思路。参考文献[1]袁建国.浅析食品腐败变质的危害及应对措施[J].科技传播,2011(14):53+57.[2]杨宪时,许钟,肖琳琳.水产食品特定腐败菌与货架期的预测和延长[J].水产学报,2004(01):106-111.[3]GhalyAE,DaveD,BudgeS,BrooksMS.FishSpoilagemechanismsandpreservationtechniques:review.AmJApplSci.2010,7(7):859-877[4]GramLone,DalgaardPaw.Fishspoilagebacteria--problemsandsolutions..2002,13(3):262-6.[5]李婷婷,丁婷,邹朝阳,周凯,仪淑敏,励建荣.0℃冷藏下三文鱼片菌相变化规律及特定腐败菌的分离鉴定.现代食品科技.2015,31(4):36-41[6]郭全友,许钟,杨宪时.冷藏罗非鱼特定腐败菌的鉴定和生长动力学.渔业科学进展,2009,30(4):117-123[7]陈桂芳,李学鹏,王彦波,朱军莉,孙力军,李春,励建荣.肉桂油对大菱鲆荧光假单胞菌腐败能力的抑制作用.食品工业科技.2016,37(8):313-317[8]MaullKD,HickeyME,LeeJL.Thestudyandidentificationofbacterialspoilagespeciesisolatedfromcatfishduringrefrigeratedstorage.JFoodProcessTechnol.2012,S11-003[9]J.Ouyang,F.Sun,W.Feng,Y.Sun,X.Qiu,L.Xiong,Y.Liu,Y.Chen.Quercetinisaneffectiveinhibitorofquorumsensing,biofilmformationandvirulencefactorsinPseudomonasaeruginosa[J].JournalofAppliedMicrobiology,2016,120(4).[10]RemenantB,JaffrèsE,DoussetX,PiletMF,ZagorecM.Bacterialspoilersoffood:behavior,fitnessandfunctionalproperties.FoodMicrobiol.2015,45(PtA):45-53[11]SchellhornHE.ElucidatingthefunctionoftheRpoSregulon.FutureMicrobiol.2014,9(4):497-507[12]綦国红,董明盛,陈晓红,姜梅.鱼源假单胞菌群体感应信号分子与腐败特性相关关系的研究.中国农业科学.2007,40(7):1486-1491[13]崔方超,李婷婷,刘明爽,马燕,励建荣.大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究[J].现代食品科技,2015,31(12):49-55.[14]SchusterM,HawkinsAC,HarwoodCS,GreenbergEP.ThePseudomonasaeruginosaRpoSregulonanditsrelationshiptoquorumsensing.MolMicrobiol.2004,51(4):973-985[15]WongtrakoongateP,TumapaS,TungpradabkulS.RegulationofaquorumsensingsystembystationaryphasesigmafactorRpoSandtheirco-regulationoftargetgenesinBurkholderiapseudomallei.Microbiol.Immunol.2012,56(5):281-294[16]LiT,CuiF,BaiF,ZhaoG,LiJ.InvolvementofAcylatedHomoserineLactones(AHLs)ofAeromonassobriainspoilageofrefrigeratedturbot(ScophthalmusmaximusL.).Sensors.2016,16(7):1083.[17]ZhaoA,ZhuJ,YeX,GeY,LiJ.InhibitionofbiofilmdevelopmentandspoilagepotentialofShewanellabalticabyquorumsensingsignalincell-freesupernatantfromPseudomonasfluorescens.InternationalJournalofFoodMicrobiology,2016,230:73-80.[18]LiuX,LiJ,WangY,LiT,ZhaoJ,ZhangC.GreenteapolyphenolsfunctionasprooxidantstoinhibitPseudomonasaeruginosaandinducetheexpressionofoxidativestress-relatedgenes.FoliaMicrobiol(Praha).2013,58(3):211-217.[19]LiuXiaoxiang,XuJun,ZhuJunli,etal.CombinedTranscriptomeandProteomeAnalysisofRpoSRegulonRevealsItsRoleinSpoilagePotentialofPseudomonasfluorescens..2019,10:94.[20]DalgaardP.Qualitativeandquantitativecharacterizationofsp