3.2 基因工程的基本操作程序 第2课时课件高二下学期生物人教版选择性必修3

人教版（2019）高中生物选择性必修33.2

基因工程的基本操作程序第2课时：基因表达载体的构建道县第二中学唐莉琴

奋发、勤学、严谨、求实SZ-LWH

学习目标1.生命观念：理解基因表达载体的结构与功能关系，形成

结构与功能相适应的生命观念。2.科学探究：通过探究与模型建构，掌握基因工程核心技

术，提升科学探究能力。

3.科学思维：对比不同限制酶切割方案，能选择最优方法并论证，锻炼科学思维。

4.社会责任：关注我国转基因棉花最新研究进展，参与相关议题分析，培养社会责任感。//奋发、勤学、严谨、求实“棉花是最美的那朵花！”

—“中国抗虫棉之父”郭三堆

思考问题：通过PCR获取了足够量的苏云金芽孢杆菌Bt抗虫蛋白基因后，如何

获得能抵抗棉铃虫的棉花植株？与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定基因工程的基本操作程序培育转基因抗虫棉的简要过程基因表达载体的构建——基因工程的核心工作【资料】游离的

DNA

进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的

DNA

片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若游离DNA能整合到染色体DNA上，或者能在细胞内独立稳定存在，能自我复制，则该游离DNA会随着细胞分裂传给子代。思考‧讨论1.通过PCR获取了足够量的苏云金芽孢杆菌Bt抗虫蛋白基因后，能不能直接将它导入棉花细胞内？不能，需要构建基因表达载体一、构建基因表达载体的目的探究构建基因表达载体的目的任务一基因表达载体的构建——基因工程的核心工作【资料】游离的

DNA

进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的

DNA

片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若游离DNA能整合到染色体DNA上，或者能在细胞内独立稳定存在，能自我复制，则该游离DNA会随着细胞分裂传给子代。思考‧讨论2.构建基因表达载体的目的是什么？让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。3.要使Bt抗虫蛋白基因在棉花细胞中稳定存在并能够表达、发挥作用，构建好的基因表达载体需要具备哪些结构？目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点4.基因表达载体具备的这些结构各自行使什么功能？质粒基因表达载体的构建——基因工程的核心工作二、基因表达载体的结构分析基因表达载体的结构及功能任务二启动子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：

识别和结合的部位，驱动基因转录出

。DNA上游RNA聚合酶mRNA终止子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：终止

。DNA下游转录标记基因：作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。复制原点：DNA复制的起始位点。限制酶切割位点：插入目的基因目的基因：能控制表达所需要的特殊性状，必须插到

和

之间。启动子终止子基因表达载体的构建——基因工程的核心工作知识拓展：启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止转录翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较基因表达载体的构建——基因工程的核心工作知识拓展：启动子的类型(1)

组成型启动子:(2)组织特异性启动子:(3)诱导型启动子:这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。基因表达载体的构建——基因工程的核心工作分析基因表达载体的构建过程任务三三、基因表达载体的构建目的基因限制酶切割位点标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶限制酶DNA连接酶重组DNA分子①

用一定的

切割载体，使其出现一个切口。限制酶②

用

限制酶或能产生

的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

将切下的目的基因片段拼接到

处，再加入适量

，形成了一个重组DNA分子。同种相同末端载体的切口DNA连接酶基因表达载体的构建——基因工程的核心工作分析基因表达载体的构建方法任务四三、基因表达载体的构建

利用课前准备的剪纸材料模拟基因表达载体的构建探究活动一：可供选择的限制酶：载体载体基因表达载体的构建——基因工程的核心工作分析基因表达载体的构建方法任务四三、基因表达载体的构建希沃白板摄像投屏展示学生模拟构建的过程，拍照展示构建成果并评价成果展示：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作分析基因表达载体的构建方法任务四三、基因表达载体的构建希沃白板摄像投屏展示学生模拟构建的过程，拍照展示构建成果并评价成果展示：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作分析基因表达载体的构建方法任务四三、基因表达载体的构建能力提升：（1）构建基因表达载体时，能否用

XbaI或

HindIII限制酶切割质粒？为什么？不能XbaI会破坏质粒的抗生素抗性基因HindIII会破坏质粒的启动子基因表达载体的构建——基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建能力提升：（2）请选择合适的限制酶对质粒和Bt抗虫蛋白基因进行切割，形成重组载体？方案一：EcoRI方案三：EcoRI和BamHI方案二：BamHI基因表达载体的构建——基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建（3）思考每种方案的连接情况，从以上3个方案中选择一个最优方案

。

方案三：EcoRI和BamHI能力提升：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1方案一和方案二单酶切的连接情况单酶切VS双酶切：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建方案三双酶切的连接情况目的基因ABab正向连接AabBabBA反向连接双酶切优点：①避免质粒自身环化；②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接。使用“双酶切”时，要注意方向性正接反接载体单酶切VS双酶切：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作三、基因表达载体的构建（4）思考讨论：应该选择什么限制酶对上图所示的质粒和目的基因进行切割，形成重组载体？

方案：HindIII和

BamHI素养进阶：使用“双酶切”时，要注意方向性，通过题目信息判断目的基因的转录方向。基因表达载体的构建——基因工程的核心工作归纳梳理：

基因表达载体的构建方法（重点在于限制酶的选择）(1)不破坏目的基因原则。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，提高筛选成功率。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。限制酶的选择原则基因表达载体的构建——基因工程的核心工作思考‧讨论：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？目的基因外源

DNA5’3’3’5’使用引物设计引入限制酶识别序列，通过PCR扩增实现突变。解决措施：基因表达载体的构建——基因工程的核心工作5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'3'3'3'引物1引物2引入限制酶识别序列引入限制酶识别序列5'3'3'5'3'3'5'3'3'3'5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'3'5'3'3'思考‧讨论：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？使用引物设计引入限制酶识别序列，通过PCR扩增实现突变。课堂练习1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因

等组件C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因

的表达D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别B课堂练习2.HindⅢ、BamHI、XhoI表示3种限制酶且切割DNA产生的黏性末端不同。据此回答下列问题：

若瘦素基因两端没有合适的限制酶酶切位点，为使瘦素基因能正确插入P载体中，应在图中引物1和2的

（填“3'”或“5'”）端分别添加

（填“HindⅢ”或“BamHⅠ”或“XhoⅠ”）的识别序列。

5'HindⅢ、BamHI（

顺序不能换）课堂总结基因表达载体的构建基因表达载体的结构基因表达载体的构建过程及