DB43∕T 985-2015 辣椒花药培养技术规程

ICS65.020.20DB43DB43/T985—2015辣椒花药培养技术规程2015-01-23发布2015-03-23实施湖南省质量技术监督局发布IDB43/T985—2015前言 Ⅱ 2规范性引用文件 3术语与定义 3.1花药培养 3.2单核靠边期 3.3胚状体 3.4单倍体 4试剂 5仪器和设备 6培养基配制与灭菌 7炼苗基质配制与灭菌 8花药培养技术流程 8.1花蕾采集 8.2花蕾处理 8.3花蕾消毒 8.4花药接种 8.5花药培养 8.6胚状体分化成苗 8.7组培苗炼苗与移栽 8.8组培苗倍性鉴定 附录A（规范性附录）辣椒花药培养档案记载表 DB43/T985—2015本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省蔬菜研究所提出。本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：湖南省蔬菜研究所。本标准主要起草人：杨博智、周书栋、王利群、欧立军、邹学校、戴雄泽、马艳青、李雪峰、张竹青、陈文超，梁成亮。DB43/T985—2015辣椒花药培养技术规程本标准规定了辣椒花药培养技术流程。本标准适用于辣椒花药培养。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008中国国家实验室分析用超纯水标准3术语与定义下列术语与定义适用于本标准。3.1花药培养指采用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序诱导其分化，并连续进行有丝分裂形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织----愈伤组织，或分化成胚状体，形成完整的植株的一种培养方式。3.2单核靠边期指四分体的胼胝质壁完全溶解后，中央大液泡开始形成，将细胞核从中心挤压到靠近细胞壁时所处的时期，此时花蕾形态特征为花瓣微露出花萼或与花萼齐平。3.3胚状体指辣椒花粉粒（小孢子）经过雄核发育成为多细胞花粉后，细胞数目进一步增加，花粉外壁膨大，冲破花粉壁，形成的多细胞团。胚状体按生长阶段分为原胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚。3.4单倍体体细胞中含有本物种配子的染色体数目的个体。4试剂4.1超纯水应符合GB/T6682中规定的三级超纯水。4.2试剂DB43/T985—2015消毒试剂：酒精、次氯酸钠；无机试剂：硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、三氧化钼、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、EDTA二钠盐；有机试剂：肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、叶酸、生物素、核糖核酸酵母、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸；生长调节剂：a-萘乙酸、激动素；其它试剂：硝酸银、秋水仙碱、琼脂粉、活性炭和蔗糖。所有试剂等级均为分析纯。5仪器设备超纯水仪、电子分析天平（精确度：0.0001g）、pH计（或pH试纸）、刻度容量瓶、移液管、恒温培养箱（温度范围：5～65℃)、电磁炉、超净工作台、高压灭菌锅、电热恒温干燥箱（温度范围：5~300℃)。6培养基配制与灭菌花药培养基成分为：每升培养基中含有720mg硝酸铵、950mg硝酸钾、166mg氯化钙、185mg七水硫酸镁、68mg磷酸二氢钾、10mg硼酸、25mg四水硫酸锰、10mg七水硫酸锌、0.25mg三氧化钼、0.025mg硫酸铜、0.025mg氯化钴、27.8mg硫酸亚铁、37.8mgEDTA二钠盐、100mg肌醇、5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.5mg盐酸硫胺素、2mg甘氨酸、0.5mg叶酸、0.05mg生物素、0.5mg核糖核酸酵母、0.8g谷氨酰胺、0.3g丝氨酸、0.1mg脯氨酸、0.25mga-萘乙酸、1.00mg激动素、0.5g硝酸银、0.03g秋水仙碱、6g琼脂粉、2.5g活性炭、30g蔗糖。胚状体分化成苗培养基成分为：每升培养基中含有1650mg硝酸铵、1900mg硝酸钾、440mg氯化钙、370mg七水硫酸镁、170mg磷酸二氢钾、0.83mg碘化钾、6.2mg硼酸、22.3mg四水硫酸锰、8.6mg七水硫酸锌、0.25mg钼酸钠、0.025mg硫酸铜、0.025mg氯化钴、27.8mg硫酸亚铁、37.8mgEDTA二钠盐、100mg肌醇、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.1mg盐酸硫胺素、2.0mg甘氨酸、6g琼脂粉、30g蔗糖。培养基配制后调pH值为5.8～6.0，然后置于高压灭菌锅中120℃,1.06kg/cm2条件下灭菌15min。7炼苗基质配制与灭菌蛭石和珍珠岩按1:1比例混合后分装成0.5kg/袋，置于电热恒温干燥箱中180℃消毒1h。8花药培养技术流程8.1花蕾采集选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取始花期后30d之内处于单核靠边期的花蕾，装入底部铺有湿润棉花的培养皿中，将培养皿置于冰箱中4°C预处理48h。8.2花蕾处理用尖头镊子在花蕾表面中部处划圈，剥去花蕾上半部分处的花萼，露出花瓣，冲洗干净。DB43/T985—20158.3花蕾消毒超净工作台上将处理后的花蕾装入尼龙网袋中，浸入70%酒精中消毒30s后，无菌蒸馏水冲洗1-2次，再用5%次氯酸钠溶液消毒12min后，无菌蒸馏水冲洗2～3次，将花蕾放入已消毒的垫有双层滤纸的培养皿中，吸干花蕾表面水分，用于接种。8.4花药接种用尖头镊子挑开花瓣，取出花药，去除花丝，接种于花药培养基表面，盖好盖子，用封口膜封口，标注实验材料名称和接种日期。8.5花药培养将培养皿放入恒温培养箱中35°C下黑暗培养8d，再于25°C下继续黑暗培养至胚状体产生，培养过程中注意观察花药染菌情况，如发现有染菌的花药出现，立即取出该培养皿，以免污染其它培养皿。8.6胚状体分化成苗当花药分化出胚状体时，剥取胚状体，接种于胚状体分化成苗培养基中培养至成苗。将培养瓶放入光照培养室中，培养条件为白天（24～26）°C，晚上（22～24）°C，光照时间（14～15）h，光照强8.7组培苗炼苗与移栽将4-7叶的组培苗取出，自来水下冲洗掉培养基，栽种于装有炼苗基质的盆中，浇水后用塑料袋覆盖保湿，置于与光照培养室条件一致的炼苗室中。7d后取掉塑料袋，将炼