RNA干扰SATB1基因：解锁乳腺癌干细胞Wnt信号通路的分子奥秘

RNA干扰SATB1基因：解锁乳腺癌干

细胞Wnt信号通路的分子奥秘

一、引言

1.1研究背景与意义

乳腺癌作为全球女性发病率和死亡率最高的癌症之一，严重威胁着女性的生命健康与生活质

量。据相关数据显示，在我国，乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤的首位，且呈逐年上升趋

势，2014年中国女性乳腺癌发病率为21.62/10万，死亡率为4.75/10万。而在全球范围

内，每分钟就有4名女性被确诊患有乳腺癌、1名女性因该疾病去世，形势不容乐观。尽管目

前乳腺癌的治疗手段众多，包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等，但复发和转移

仍然是乳腺癌治疗面临的主要难题。一旦乳腺癌复发或转移，患者的5年生存率将显著降

低，严重影响其预后。

乳腺癌复发转移的根源在于乳腺癌干细胞的存在。乳腺癌干细胞是乳腺癌肿瘤中一小部分具有

自我更新和再分化能力的癌细胞，它们与乳腺癌的转移、复发以及对化疗和放疗的抵抗性密

切相关。乳腺癌干细胞能够在治疗过程中存活下来，并重新启动肿瘤的生长，导致疾病的复发

和恶化。深入研究乳腺癌干细胞的生物学特性和相关信号通路，对于揭示乳腺癌复发转移的机

制，开发有效的治疗策略具有重要怠义。

Wnt信号通路在乳腺癌干细胞的维持、增殖和分化等过程中发挥着关键作用。该信号通路的

异常激活与乳腺癌的发生、发展、转移以及耐药性密切相关。当Wnt信号通路激活时，Wnt

蛋白与细胞膜上的受体结合，通过一系列的信号转导过程，最终调节下游靶基因的表达，从而

影响细胞的生物学行为。在乳腺癌干细胞中，Wnt信号通路的持续激活能够维持其干细胞特

性，促进其自我更新和增殖，同时抑制其分化，使得乳腺癌干细胞能够逃避常规治疗，导致肿

瘤的复发和转移。对Wnt信号通路的研究，有望为乳腺癌的治疗提供新的靶点和策略。

富含AT序列的特异结合蛋白1(SATB1)是一种组织特异性表达的核基质序列特异性结合蛋

白，参与染色质高级结构的形成和组织特异性基因的表达调控，在免疫调节、肿瘤转移和凋亡

等方面发挥着重要作用。已有研究表明，SATB1在乳腺癌组织中高表达，且其表达水平与乳

腺癌的恶性程度、转移和预后密切相关。SATB1可以通过调控一系列基因的表达，影响乳腺

癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学行为。然而，SATB1对乳腺癌干细胞Wnt信号

通路的影响及其分子机制尚不完全清楚。

本研究旨在通过RNA干扰技术沉默SATB1基因，探讨其对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影

响，揭示SATB1在乳腺癌干细胞中的作用机制，为乳腺癌的治疗提供新的理论依据和潜在的

治疗靶点。研究成果有望为开发针对乳腺癌干细胞的靶向治疗策略提供重要的参考，为改善乳

腺癌患者的预后带来新的希望。

1.2国内外研究现状

在乳腺癌干细胞的研究方面，国内外学者已取得了一系列重要成果。国外研究团队如［具体团

队1］通过单细胞测序技术，深入分析了乳腺癌干细胞的基因表达谱，发现了多个与干细胞特

性相关的关键基因，为乳腺癌干细胞的鉴定和靶向治疗提供了新的分子标志物。［具体团队2］

则利用小鼠模型，研究了乳腺癌干细胞在肿瘤转移过程中的作用机制，揭示了乳腺癌干细胞通

过上皮-间质转化(EMT)获得更强的迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的远处转移。在国内，

［具体团队3］通过建立乳腺癌患者来源的类器官模型，成功地富集和培养了乳腺癌干细胞，并

对其生物学特性进行了详细研究，为乳腺癌干细胞的研究提供了更接近临床实际的实验模

型。

关于Wnt信号通路，其在胚胎发育、组织再生和疾病发病机制等生物学过程中发挥关键作

用。在国外，［具体团队4］解析了Wnt信号通路中FZD/DVL复合物的冷冻电镜结构，揭示了

FZDs与DVL结合的通用机制，即Wnt信号传导的经典途径的分子机制，为理解Wnt信号途

径激活的机制和相关药物设计提供了重要依据。［具体团队5］通过基因编辑技术，敲除小鼠体

内Wnt信号通路的关键基因，研究其对乳腺癌发生发展的影响，发现Wnt信号通路的异常激

活可促进乳腺癌的发生和进展。国内方面，［具体团队6］利用3D生物打印技术，在体外构建

了具有正常功能的人类心脏器官模型，并通过激活经典Wnt信号通路，成功诱导人多能干细

胞分化为功能性房室结细胞，为Wnt信号通路在组织工程和再生医学中的应用提供了新的思

路。

对于SATB1基因，国外［具体团队7］研究发现SATB1在乳腺癌组织中的表达水平明显高于

正常乳腺组织，且其高表达与乳腺癌的不良预后密切相关。［具体团队8］通过细胞实验和动物

实验，证实SATB1可以通过调控一系列基因的表达，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

国内［具体团队9］对SATB1在甲状腺癌中的表达及功能进行了研究，发现SATB1与甲状腺

癌侵袭转移有关，其高表达具有促进甲状腺癌细胞上皮细胞间质转化(EMT)的作用，

PI3K/Akt信号通路可能参与了SATB1的促转移过程。

然而，目前关于RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路影响的研究仍存在不

足。虽然已有研究表明SATB1与乳腺癌的发生发展密切相关，Wnt信号通路在乳腺癌干细胞

中也发挥看重要作用，但二者之间的具体联系及分子机制尚未完全明确。在已有的研究中，针

对SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影响，缺乏系统的、深入的研究。多数研究

仅停留在细胞水平的初步探索，对于其在体内的作用机制以及与其他信号通路的相互作用等方

面的研究还较为匮乏。此外，目前的研究方法和技术也存在一定的局限性，难以全面、准确地

揭示SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的调控机制。因此，深入研究RNA干扰

SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影响，具有重要的理论和实际意义，有望为乳腺

癌的治疗提供新的靶点和策略。

1-3研究目的与内容

本研究旨在深入探究RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞Writ信号通路的影响，揭示

SATB1在乳腺癌干细胞中的作用机制，为乳腺癌的治疗提供新的理论依据和潜在的治疗靶

点。具体研究内容如下：

1.构建SATB1-shRNA慢病毒表达载体并筛选稳转细胞株：依据RNA干扰技术原理，设

计并合成针对SATB1基因的小发夹RNA（shRNA）序列，将其克隆至慢病毒表达载体

中，构建SATB1-shRNA慢病毒表达载休°随后，利用该载休转染乳腺癌细胞，通过噂

吟霉素筛选，获得稳定表达SATB1-shRNA的稳转细胞株。在此过程中，运用实时荧光

定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，对稳转细胞株中

SATB1基因和蛋白的表达水平进行检测，以确保干扰效果的有效性。此部分研究内容是

后续实验的基础，稳定的干扰细胞株能够为深入研究SATB1基因对乳腺癌干细胞的影响

提供可靠的实验材料。通过构建和筛选稳转细胞株，能够实现对SATB1基因的持续干

扰，从而更准确地观察其对细胞生物学行为的影响。

2.分选乳腺癌干细胞并鉴定：从乳腺癌细胞系或乳腺癌组织中，运用流式细胞术或磁珠分选

技术，依据乳腺癌干细胞的表面标志物（如CD44+/CD24-）,分选出乳腺癌干细胞。接

着，采用成球实验、克隆形成实验以及体内成瘤实验等方法，对分选得到的乳腺癌干细胞

的自我更新能力、增殖能力和致瘤能力进行鉴定。明确乳腺癌干细胞的特性，能够为后续

研究提供精准的研究对象，确保研究结果的准确性和可靠性。通过分选和鉴定乳腺癌干细

胞，可以获得高纯度的干细胞群体，便于深入研究其生物学特性和相关信号通路。

3.检测RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路相关基因和蛋白表达的影响：

将SATB1-shRNA慢病毒表达载体转染乳腺癌干细胞，设置对照组（转染空载体或未转

染的乳腺癌干细胞）。在转染后的不同M间点，利用qRT-PCR技术检测Wnl信号通路

相关基因（如Wnt1、p-catenin.TCF4等）的mRNA表达水平变化；运用Westernblot

技术检测相关蛋白（如Wnt1、p-catenin.p-p-catenin.TCF4等）的表达水平变化；

采用免疫荧光染色技术观察P-catenin在细胞内的定位变化。全面了解RNA干扰SATB1

基因后，Wnt信号通路相关基因和蛋白的表达及定位变化，有助于揭示SATB1基因对

Wnt信号通路的调控机制。通过多种技术手段的综合运用，可以从不同层面深入研究

SATB1基因对Wnt信号通路的影响，为进一步探讨其作用机制提供有力的证据。

4.检测RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞生物学行为的影响：通过细胞增殖实验（如

CCK-8法、EdU法）检测干扰SATB1基因后乳腺癌干细胞的增殖能力变化；利用细胞

迁移实验（如Transwell小室实验、划痕实验）和细胞侵袭实验（如Matrigel包被的

Transwell小室实验）检测其迁移和侵袭能力变化；采用细胞凋亡实验（如AnnexinV-

FITC/PI双染法、TUNEL法）检测细胞凋亡率的变化；通过成球实验检测其自我更新能力

的变化。深入了解RNA干扰SATB1基因对乳腺癌干细胞生物学行为的影响，能够明确

SATB1基因在乳腺癌干细胞中的功能，为乳腺癌的治疗提供新的靶点和策略。通过对乳腺

癌干细胞生物学行为的全面检测，可以直观地反映出SATB1基因对其的影响，为进一步

研究其作用机制和开发治疗策略提供重要的实验依据。

5.探讨RNA干扰SATB1基因影响乳腺癌干细胞Wnt信号通路的分子机制：基于前期实验

结果，运用双荧光素酶报告基因实验验证SATB1与Wnt信号通路关键基因启动子区域的

结合作用；通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验检测SATB1在Wnt信号通路相关基因染色

质上的结合情况；利用蛋白质•蛋白质相互作用实验（如免疫共沉淀、GSTpull-down实

验）探究SATB1与Wnt信号通路相关蛋白之间的相互作用。深入揭示RNA干扰SATB1

基因影响乳腺癌干细胞Wnt信号通路的分子机制，为孔腺癌的治疗提供更深入的理论依据

和潜在的治疗靶点。通过多种分子生物学实验方法的联合应用，可以从分子层面深入剖析

SATB1基因对Wnt信号通路的调控机制，为开发有效的治疗策略提供坚实的理论基础。

1.4研究方法与技术路线

本研究综合运用多种先进的实验技术和方法，从细胞和分子水平深入探究RNA干扰SATB1

基因对乳腺癌干细胞Wnt信号通路的影响，具体研究方法如下：

1.RNA干扰技术：依据RNA干扰的原理，设计并合成针对SATB1基因的小发夹RNA

（shRNA）序列。通过将shRNA序列克隆至慢病毒表达载体中，构建SATB1-shRNA慢

病毒表达载体。该技术能够特异性地降解SATB1基因的mRNA、从而实现对SATB1基因

表达的有效干扰，为后续研究提供稳定的干扰细胞模型。

2.慢病毒转染技术：利用慢病毒作为载体，将构建好的SATB1-shRNA慢病毒表达载体导

入乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞中。慢病毒具有高效感染、稳定整合到宿主基因组等优点，

能够确保shRNA在细胞内持续稳定表达，实现对SATB1基因的长期干扰。

3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术：提取细胞总RNA,反转录为cDNA后，以其为

模板，利用特异性引物对Wnt信号通路相关基因（如Wnt1、p-catenin.TCF4等）的

mRNA表达水平进行检测。通过qRT-PCR技术，可以准确地定量分析基因表达量的变

化，为研究RNA干扰SATB1基因对Wnt信号通路相关基因表达的影响提供数据支持。

4.蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术：提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后，

将蛋白转移至PVDF膜上，用特异性抗体检测Wnt信号通路相关蛋白（如

catenin.p-p-cateninsTCF4等）的表达水平。Westernblot技术能够从蛋白质水平直

观地反映出相关蛋白表达量的变化，有助于深入了解RNA干扰SATB1基因对Wrt信号

通路相关蛋白表达的影响。

5.免疫荧光染色技术：将细胞固定在载玻片上，用特异性抗体标记B-catenin,通过荧光显

微镜观察P-catenin在细胞内的定位变化。免疫荧光染色技术可以直观地展示P-catenin

在细胞内的分布情况，为研究Wnt信号通路的激活状态提供重要信息。

6.细胞增殖实验（CCK-8法、EdU法）：CCK-8法是利用细胞增殖时线粒体中的脱氧酶

能够将CCK-8试剂中的四嘤盐还原为具有颜色的甲瓒产物，通过检测甲瓒产物的吸光度

值来反映细胞的增殖情况；EdU法是将EdU（一种胸腺喀嚏核昔类似物）加入到细胞培养

基中，EdU能够在细胞DNA合成期（S期）掺入到新合成的DNA中，通过荧光染色检测

EdU的掺入情况，从而反映细胞的增殖活性。这两种方法能够准确地检测干扰SATB1基

因后乳腺癌干细胞的增殖能力变化。

7.细胞迁移实验（Transwell小室实验、划痕实验）和细胞侵袭实验（Matrigel包被的

Transwell小室实验）：Transwell小室实验是将细胞接种在上室，下室加入含有趋化因子

的培养基，细胞会向趋化因子浓度高的方向迁移或侵袭，通过计数迁移或侵袭到下室的细

胞数量来评估细胞的迁移和侵袭能力；划痕实验是在细胞单层上制造划痕，观察细胞向划

痕处迁移的情况，以此来评估细胞的迁移能力；Matrigel包被的Transwell小室实验则是在

上室底部预先包被Matrigel基质胶，模拟细胞外基质，检测细胞穿过基质胶的能力，从而

评估细胞的侵袭能力。这些实验能够直观地反映干扰SATB1基因后乳腺癌干细胞迁移和

侵袭能力的变化。

8.细胞凋亡实验（AnnexinV-FITC/PI双染法、TUNEL法）：AnnexinV-FITC/PI双染法

是利用AnnexinV能够特异性地与凋亡早期细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸结合，PI能够对

坏死细胞和晚期凋亡细胞的细胞核进行染色，通过流式细胞仪检测不同荧光标记的细胞比

例，从而区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞；TUNEL法是利用末端

脱氧核甘酸转移菊将生物素或地高辛等标记的dUTP连接到凋亡细胞断裂的DNA31-0H末

端，再通过与标记物特异性结合的荧光素或酶底物显色，从而检测细胞凋亡情况。这两种

方法能够准确地检测干扰SATB1基因后乳腺癌干细胞凋亡率的变化。

9.成球实验：将乳腺癌干细胞接种在低吸附培养板中，加入含有生长因子的无血清培养基，

培养一段时间后，观察细胞形成乳腺球的能力。成球实验能够直接反映乳腺癌干细胞的自

我更新能力，通过比较干扰SATB1基因前后细胞成球的数量和大小，可评估SATB1基因

对乳腺癌干细胞自我更新能力的影响。

10.双荧光素酶报告基因实验：构建含有Wnt信号通路关键基因启动干区域的荧光素酶报告

基因载体，与SATB1表达载体或对照载体共转染细胞。通过检测荧光素酶的活性，脸证

SATB1与Wnt信号通路关键基因启动子区域的结合作用，从而明确SATB1对Wnt信号

通路关键基因转录的调控机制。

11.染色质免疫沉淀（ChIP）实验：利用抗体特异性地结合并沉淀目标蛋白-DNA复合物，

然后对沉淀下来的DNA进行PCR扩增或测序分析，检测SATB1在Wnt信号通路相关基

因染色质上的结合情况，进一步验证SATB1与Wnt信号通路相关基因的相互作用。

12.蛋白质•蛋白质相互作用实验（免疫共沉淀、GSTpull・down实验）：免疫共沉淀实验

是利用抗体将与目标蛋白相互作用的蛋白质一起沉淀下来，通过Westernblot检测沉淀中

的蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用；GSTpull-down实验是将谷胱甘肽-S-转

移酶（GST）融合蛋白与目标蛋白在体外孵育，利用GST与谷胱甘肽亲和柱的特异性结

合，将与目标蛋白相互作用的蛋白质分离出来，通过蛋白质印迹或质谱分析鉴定相互作用

的蛋白质。这两种实验方法能够深入探究SATB1与Wnt信号通路相关蛋白之间的相互作

用关系。

技术路线图展示了本研究的整体实验流程（见图1）。首先，设计并合成针对SATB1基因的

shRNA序列，构建SATB1-shRNA慢病毒表达载体，转染乳腺癌细胞，筛选出稳定表达

SATB1・shRNA的稳转细胞株。接着，从乳腺癌细胞系或乳腺癌组织中，运用流式细胞术或

磁珠分选技术，依据乳腺癌干细胞的表面标志物（如CD44+/CD24-）,分选出乳腺癌干细

胞，并进行鉴定。随后，将SATB1-shRNA慢病毒表达载体转染乳腺癌干细胞，设置对照

组，分别利用qRT-PCR、Westernblot,免疫荧光染色等技术检测Wnt信号通路相关基因

和蛋白的表达及定位变化；通过细胞增殖实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验、细胞凋亡实

验、成球实验等检测乳腺癌干细胞生物学行为的变化。最后，运用双荧光素酶报告基因实验、

ChIP实验、蛋白质・蛋白质相互作用实验等探讨RNA干扰SATB1基因影响乳腺癌干细胞

Wnt信号通路的分子机制。

［此处插入技术路线图］

图1技术路线图

二、相关理论基础

2.1乳腺癌与乳腺癌干细胞

乳腺癌是一种起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，在全球范围内，其发病率和死亡率在女性恶性

肿瘤中均位居前列，严重威胁着女性的生命健康和生活质量。据世界卫生组织国际癌症研究

机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，2020年全球女性乳腺癌新发病例达

226万例，死亡病例达68万例，发病率和死亡率均居女性恶性肿瘤首位。在中国，乳腺癌的

发病率也呈逐年上升趋势，且发病年龄逐渐年轻化。2020年中国女性乳腺癌新发病例约为42

万例，占女性恶性肿瘤新发病例的19.9%。

目前，乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等。手术

治疗是乳腺癌的主要治疗方法之一，包括乳房切除术和保乳手术等。化疗则是通过使用化学

药物来杀死癌细胞，常用的化疗药物包括慈环类、紫杉类等。放疗是利用高能射线对肿瘤部

位进行照射，以杀死癌细胞。内分泌治疗主要针对激素受体阳性的乳腺癌患者，通过抑制雌

激素的合成或作用来抑制肿瘤细胞的生长。靶向治疗则是针对肿瘤细胞的特定分子靶点，使

用特异性的药物进行治疗，如抗HER2靶向治疗等。然而，尽管这些治疗手段在一定程度上

提高了乳腺癌患者的生存率，但仍有部分患者会出现复发和转移，这是导致乳腺癌患者死亡的

主要原因O

乳腺癌干细胞是乳腺癌肿瘤组织中一小部分具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性的细

胞O这些细胞具有与正常干细胞相似的特性，能够在肿瘤组织中保持相对静止的状态，逃避

常规治疗的杀伤。当肿瘤组织受到刺激时，乳腺癌干细胞能够迅速增殖和分化，形成新的肿

瘤细胞，导致肿瘤的复发和转移。乳腺癌干细胞的存在被认为是乳腺癌治疗失败的重要原因

之一。

乳腺癌干细胞具有一些独特的特性。首先，它们具有自我更新能力，能够不断地产生新的干

细胞和分化细胞，维持肿瘤的生长和发展。其次，乳腺癌干细胞具有多向分化潜能，能够分

化为不同类型的肿瘤细胞，形成肿瘤的异质性。此外，乳腺癌干细胞还具有高致瘤性，少量

的乳腺癌干细胞就能够在体内形成肿瘤。研究表明，将100个CD44+/CD24-的乳腺癌干

细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，就能够形成肿瘤，而需要注射10万个以上的非干细胞才能形

成肿瘤。

目前，常用的乳腺癌干细胞分离鉴定方法主要包括基于表面标志物的分选法、流式细胞术分选

法和条件培养基筛选法等。基于表面标志物的分选法是利用乳腺癌干细胞表面特启的标志

物，如CD44、CD24、ALDH1等，采用免疫磁珠分选、荧光激活细胞分选等技术将其分离出

来。研究发现，CD44+/CD24-的细胞亚群具有乳腺癌干细胞的特性，能够在体外形成乳腺

球，并且具有较强的致瘤性。流式细胞术分选法则是根据细胞表面标志物的表达情况，通过

流式细胞仪对细胞进行分选，能够获得高纯度的乳腺癌干细胞。条件培养基筛选法是利用乳

腺癌干细胞在特定条件下的生长特性，将肿瘤组织接种于无血清培养基中，通过保持细胞的无

血清培养环境，诱导肿瘤组织中的乳腺癌干细胞增殖，从而实现对乳腺癌干细胞的分离和培

养。

乳腺癌干细胞在肿瘤的复发转移中发挥着关键作用。一方面，乳腺癌干细胞具有较强的迁移

和侵袭能力，能够突破基底膜，进入血液循环，从而实现肿瘤的远处转移。研究表明，乳腺

癌干细胞能够通过上皮-间质转化(EMT)过程，获得更强的迁移和侵袭能力。在EMT过程

中，乳腺癌干细胞会失去上皮细胞的特征，获得间质细胞的特性，如表达E-cadherin减少，

表达N•cadherin和Vimenlin增加等，从而使其能够更容易地迁移和侵袭到周围组织。另一

方面，乳腺癌干细胞具有耐药性，能够耐受放疗、化疗等治疗手段，这使得它们在治疗过程中

能够存活下来，成为肿瘤复发的根源。乳腺癌干细胞耐药的机制主要包括药物外排泵的高表

达、DNA损伤修复能力增强、凋亡信号通路的抑制等。例如，乳腺癌干细胞中ABCG2等药

物外排泵的表达水平较高，能够将进入细胞内的化疗药物排出细胞外，从而降低化疗药物的疗

效。

2.2Wnt信号通路

Wnt信号通路是一个在生物进化过程中高度保守的信号传导系统，在胚胎发育、组织稳态维

持以及疾病发生发展等过程中发挥着关键作用。该信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生、

发展密切相关，其中就包括乳腺癌。

Wnt信号通路主要由分泌蛋白Wnt家族、跨膜受体Frizzled(Fzd)家族、低密度脂蛋白受体

相关蛋白5/6(LRP5/6).胞内蛋白Dishevelled相美、糖原合成酶激酶30(GSK30)、

轴蛋白(Axin)、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、连环蛋白(B-catenin)以及转录因

子TCF/LEF家族等组成。根据其下游信号传导途径的不同，Wnt信号通路可分为经典Wnt

信号通路(Wnt/0-catenin信号通路)和非经典Wnt信号通路(Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+

通路)。

经典Wnt信号通路的传导机制如下：在没有Wnt信号刺激时，细胞内的p-catenin与

Axin、APC、GSK30等形成降解复合体。其中，GSK36和酪蛋白激酶1（CK1）会依次对。

-catenin的N端丝氨酸/苏氨酸残基进行磷酸化修饰。璘酸化后的p-catenin被p-转导重

复蛋白（B-TRCP）识别并结合，进而通过泛素化途径被蛋白酶体降解，使得细胞内B-

catenin的水平维持在较低状态。此时，转录因子TCF/LEF与共抑制因子Groucho结合，抑

制下游靶基因的转录。当Wnt信号激活时，Wnt配体与细胞膜上的Fzd受体和共受体

LRP5/6结合，形成Wnt-Fzd-LRP5/6复合物。这一复合物的形成会招募DvI蛋白到细胞膜

上，DvI蛋白通过与Axin相互作用，使Axin-GSK3B蛋白复合物也被招募到细胞膜处。在

细胞膜上，LRP5/6受体胞内段先后被GSK3B、Cdk14・CyclinY和CK1y磷酸化，磷酸化后

的LRP5/6为Axin提供了结合位点。这一过程使得降解复合体的功能受到抑制，p-catenin

的磷酸化和降解过程受阻，从而导致p-catenin在细胞质中稳定积累。积累的p-catenin进

入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，取代共抑制因子Groucho,从而启动下游靶基因（如

c-myc、CyclinD1等）的转录，调节细胞的增殖、分化、迁移等生物学行为。

在乳腺癌干细胞中，Wnt信号通路发挥着至关重要的作用。研究表明，Wnt信号通路的持续

激活能够维持乳腺癌干细胞的自我更新能力。当Wnt信号通路异常激活时，乳腺癌干细胞能

够不断增殖，形成新的肿瘤细胞，导致肿瘤的生长和发展。Wnt信号通路还能够抑制乳腺癌

干细胞的分化，使其保持干细胞特性。这使得乳腺癌干细胞能够逃避常规治疗，在治疗后重

新启动肿瘤的生长，导致肿瘤的复发和转移。有研究发现，在乳腺癌干细胞中，Wnt信号通

路相关基因的表达水平明显高于非干细胞，且抑制Wnt信号通路能够降低乳腺癌干细胞的自

我更新能力和致瘤性。此外，Wnt信号通路还可以通过与其他信号通路（如Notch、

Hedgehog等信号通路）相互作用，共同调控乳腺癌干细胞的生物学行为。

Wnt信号通路的异常激活与乳腺癌的发生发展密切相关。在乳腺癌组织中，常常检测到Wnt

信号通路相关基囚的突变或异常表达。例如，F-catenin基囚的突变会导致其蛋白无法被正

常降解，从而使B-catenin在细胞内持续积累，激活下游靶基因的转录，促进乳腺癌细胞的

增殖和迁移。此外，Wnt配体的过表达或Fzd受体的异常激活也会导致Wnt信号通路的过度

激活，进而促进乳腺癌的发生和发展。研究表明，Wnt信号通路的激活与乳腺癌的临床分

期、淋巴结转移以及患者的预后密切相关。高表达Wnt信号通路相关蛋白的乳腺癌患者往往

具有更差的预后。

2.3SATB1基因

富含AT序列的特异结合蛋白1（SATB1）是一种组织特异性表达的核基质序列特异性结合蛋

白，在基因表达调控、细胞分化和肿瘤发生发展等过程中发挥着关键作用。SATB1基因位于

3号染色体3P23区，全长763个氨基酸。其编码的蛋白质包含有两个CUT基序，可通过形

成类似PDZ结构的二聚体，以高度亲和力与核基质结合区（MAR）序列相结合。在SATB1

氨基酸序列的中部约有150个氨基酸，这部分氨基酸是和MAR发生结合的核心序列，并且具

有高度碱基解配对（BUR）倾向的区域。在BUR内，具有成簇的AT富含序列，包括混合的

A、T、C并以G结尾，称之为ATC序列，每个ATC序列又含有核心解链元件(CUE),

CUE的突变会消除所在区域的碱基解配对倾向，从而使SATB1对MAR的结合活性消失。

SATB1在基因表达调控中起着重要作用，它能够通过与MAR序列结合，参与染色质高级结

构的形成，进而调控组织特异性基因的表达。SATB1可以作为一种“分子支架”，在组胞核内

形成独特的空间结构，为特殊的DNA序列提供锚定位点,影响染色质开放结构的形成。当

SATB1与特定的DNA区域结合时，它可以招募各种转录因子和染色质修饰酶，促进或抑制

基因的转录。研究发现，SATB1能够与一些肿瘤相关基因的启动子区域结合，调节这些基因

的表达，从而影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为。此外，蛋白质的翻译后修饰

是其功能调节的重要方式，SATB1的磷酸化、乙酰化和小泛素化样修饰可调节其DNA结合

能力和转录调控活性。

大量研究表明，SATB1在乳腺癌组织中呈现高表达状态，且其表达水平与乳腺癌的恶性程

度、转移和预后密切相关。在一项对84例乳腺癌组织的研究中，通过免疫组织化学方法检测

发现，SATB1在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于乳腺癌旁组织，差异具有显著性。

SATB1蛋白在乳腺癌中的配性表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关，随着组

织学分级、临床分期的增加及淋巴结转移的出现，SATB1的表达水平显著升高。进一步的研

究还发现，SATB1的表达与乳腺癌患者的预后之间存在显著统计学意义，SATB1高表达提示

乳腺癌患者预后不良。

SATB1在乳腺癌中的作用机制较为复杂，其中一个重要的方面是通过调控Wnt信号道路来影

响肿瘤的发生发展。Wnt信号通路在乳腺癌干细胞的维持、增殖和分化等过程中发挥着关键

作用，而SATB1可以通过与Wnt信号通路中的关键分子相互作用，调节该信号通路的活

性。研究表明，SATB1能够与B・catenin结合，促进B-catenin在细胞核内的积累从而

增强Wnt信号通路的活性，促进乳腺癌干细胞的自我更新和增殖。SATB1还可以通过调控

Wnt信号通路相关基因的表达，影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。有研究发现，SATB1高

表达的乳腺癌细胞中，Wnt信号通路相关基因(如Wnt1、c-myc、CyclinD1等)的表达水

平明显升高，这些基因的异常表达与乳腺癌细胞的恶性生物学行为密切相关。

2.4RNA干扰技术

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种在真核生物中高度保守的转录后基因沉默机

制，它通过双链RNA(dsRNA)介导，高效、特异性地降解细胞内同源mRNA,从而实现对

靶基因表达的抑制。这一现象最早在植物和线虫中被发现。1990年，Napoli等将查尔酮合成

酶基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫色，然而结果却出乎意料，不仅转入的基因未正常表

达，而且植物自身的查尔酮合成酶基因表达也受到了抑制，花朵颜色反而变浅，这种现象被称

为共抑制。1995年，Guo和Kemphues在线虫中进行反义RNA实验时，意外发现正义

RNA也能抑制靶基因的表达，当时对此现象无法解释。直到1998年，Fire等通过实验证

实，dsRNA才是导致基因沉默的真正原因，并将这种由dsRNA介导的基因沉默现象命名为

RNA干扰。此后，RNAi技术迅速成为生命科学领域的研究热点，为基因功能研究和疾病治

疗提供了新的有力工具。

RNAi的作用机制主要包括起始阶段、效应阶段和扩增阶段。在起始阶段，外源或内源的

dsRNA进入细胞后，被一种名为Dicer的核酸酶识别并切割成21-25个核甘酸长度的小片

段，这些小片段被称为小干扰RNA(siRNA)。Dicer属于RNaselll家族，它具有解旋酶活

性以及dsRNA结合域和PAZ结构，能够精确地将dsRNA切割成具有特定长度和结构的

siRNA。在效应阶段，siRNA双链在ATP供能的情况下被RNA解旋酶解旋，其中的反义链

与细胞内的多种蛋白质组装形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。RISC中的核酸酶活性在

结合反义链后被激活，使其能够通过碱基互补配对的方式识别并结合到靶mRNA的特定序列

上，随后在距离RISC的3端11个碱基位置切割靶mRNA,导致mRNA降解，从而阻断靶

基因的表达。在扩增阶段，被切割的mRNA片段可作为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶

(RdRP)作用下合成新的dsRNA,这些新生成的dsRNA又能被Dicer切割成新的siRNA.

继续参与RNAi过程，从而实现对靶基因表达的持续抑制。这一过程使得RNAi具有信号放

大效应，少量的dsRNA即可引发强烈的基因沉默效果。

RNAi技术在基因功能研究和肿瘤治疗等领域展现出了巨大的应用潜力。在基因功能研究方

面，由于RNAi能够高度特异性地沉默特定基因，为研究基因的功能提供了一种高效的手

段。通过设计针对特定基因的siRNA或短发夹RNA(shRNA),可以在细胞水平或动物模

型中抑制该基因的表达，从而观察其对细胞生物学行为或生物体表型的影响。例如，在研究

某一未知功能基因时，利用RNAi技术将其沉默后，观察细胞的增殖、分化、凋亡等过程是否

发生改变，进而推断该基因在这些生物学过程中的作用。与传统的基因敲除技术相比，RNAi

技术具有操作简单、周期短、成本低等优势，尤其适用于对一些难以进行基因敲除的细胞系或

生物体进行基因功能研究。在肿瘤治疗领域，RNAi技术为攻克肿瘤这一难题提供了新的思路

和方法。肿瘤的发生发展往往与多个基因的异常表达密切相关，通过RNAi技术特异性地抑

制这些异常表达的基因，有望达到治疗肿瘤的目的。研究表明，可以针对肿瘤细胞中过度表

达的癌基因(如HER2、KRAS等)设计siRNA或shRNA,通过抑制这些癌基因的表达，阻

断肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学过程，从而实现对肿瘤的治疗。RNAi技术还可以与

其他治疗方法(如化疗、放疗、靶向治疗等)联合应用，增强治疗效果，降低肿瘤的复发和转

移风险。例如，将针对肿瘤耐药基因的RNAi与化疗药物联合使用，可以提高肿瘤细胞对化

疗药物的敏感性，增强化疗效果。

鉴于RNAi技术在基因功能研究和肿瘤治疗等领域的广泛应用及其显著优势，利用RNAi技术

抑制SATB1基因表达具有高度的可行性。通过设计并合成针对SATB1基因的siRNA或

shRNA,能够特异性地降解SATB1基因的mRNA,从而实现对SATB1基因表达的有效抑

制。这将为深入研究SATB1基因在乳腺癌干细胞中的作用机制提供有力的工具，有助于揭示

SATB1基因与乳腺癌干细胞Writ信号通路之间的内在联系。利用RNAi技术抑制SATB1基

因表达，还可能为乳腺癌的治疗开辟新的途径，通过干扰SATB1基因对Wnt信号通路的调

控，抑制乳腺癌干细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为，为乳腺癌的治疗提供新的潜在靶点

和策略。

三、实验材料与方法

3.1实验材料

人类乳腺癌Mcf-7细胞株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。该细胞株具有上皮细胞

形态，呈贴壁生长特性，且为雌激素受体阳性，常被广泛应用于乳腺癌的基础研究，尤其是在

雌激素相关信号通路以及乳腺癌细胞增殖、凋亡等生物学行为的研究中。

主要试剂如下：RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司j,用于细胞总蛋白的提取，其成分

包含多种离子型和非离子型去污剂，能够有效裂解细胞，释放细胞内的蛋白质；BCA蛋白定

量试剂盒（碧云天生物技术有限公司），利用双缩服反应原理，在碱性条件下，蛋白质中的肽

键与铜离子反应生成络合物，通过检测络合物的吸光度来准确测定蛋白质浓度；SDS

凝胶配制试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），包含丙烯酰胺、N,N-亚甲双丙烯酰

胺、Tris-HCI缓冲液等成分，用于制备SDS-PAGE凝胶，以实现蛋白质的分离；PVDF膜

（Millipore公司），具有良好的化学稳定性和机械强度，能够高效地吸附蛋白质，是蛋白质印

迹实验中转膜的常用材料；SATB1抗体（Abeam公司），该抗体特异性高，能够准确识别

SATB1蛋白，用于检测细胞中SATB1蛋白的表达水平；p-actin抗体（CellSignaling

Technology公司），作为它参抗体，用于校正蛋白质上样量的差异，确保实验结果的准确

性；HRP标记的山羊抗免IgG二抗（武汉博士德生物工程有限公司），与一抗特异性结合，

通过辣根过氧化物酶催化底物显色，从而实现对目标蛋白的检测；TRIzol试剂（Inv也。gen公

司），是一种新型总RNA抽提试剂，能够快速、有效地从细胞或组织中提取总RNA;逆转

录试剂盒（TaKaRa公司），包含逆转录酶、引物、缓冲液等成分，可将RNA逆转录为

cDNA,为后续的实时荧光定量PCR实验提供模板；实时荧光定量PCR试剂盒（Roche公

司），含有热启动Taq酶、dNTPs、SYBRGreenI荧光染料等，能够在PCR反应过程中实

时监测荧光信号，从而准确地定量分析基因的表达水平；口票吟霉素（Sigma公司），常用于

筛选稳定转染的细胞株，其作用机制是抑制蛋白质的合成，只有成功转染并表达抗性基因的细

胞才能在含有喋吟霉素的培养基中存活；Matrigel基质胶（Corning公司），是一种从

Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的基底膜基质，富含多种细胞外基质成

分，在细胞侵袭实验中用于模拟体内细胞外基质环境，检测细胞的侵袭能力；CCK-8试剂盒

（同仁化学研究所），利用细胞线粒体中的脱氢酶能够将CCK-8试剂中的四嘤盐还原为具

有颜色的甲瓒产物，通过检测甲瓒产物的吸光度值来准确反映细胞的增殖情况；AnnexinV-

FITC/PI凋亡检测试剂盒（BDBiosciences公司），利用AnnexinV能够特异性地与凋亡早

期细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸结合，PI能够对坏死细胞和晚期凋亡细胞的细胞核进行染

色，通过流式细胞仪检测不同荧光标记的细胞比例,从而准确地区分正常细胞、早期凋亡细

胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。

实验仪器设备包括：高速冷冻离心机（Eppendorf公司），最大转速可达15000rpm,能够在

低温条件下快速离心细胞或蛋白质样品，实现样品的分离和浓缩；PCR仪（Bi。-Rad公

司），具有温度控制精确、升降温速度快等优点，可满足逆转录和PCR扩增等实验的需求；

实时荧光定量PCR仪（ABI公司），能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号，准确地定

量分析基因的表达水平；电泳仪（Bi。-Rad公司），提供稳定的电场，用于SDS-PAGE凝

胶电泳，实现蛋白质的分离；凝胶成像系统（Tanon公司），能够对电泳后的凝胶进行成像

和分析，检测蛋白质的表达情况；酶标仪（Therm。FisherScienHfic公司），可用于检测

CCK-8实验中细胞增殖产生的吸光度值，以及BCA蛋白定量实验中蛋白质浓度对应的吸光

度值；流式细胞仪（BDBiosciences公司），通过检测细胞表面标志物或细胞内荧光信号，

对细胞进行分选和分析，在乳腺癌干细胞的分选和鉴定以及细胞凋亡检测等实验中发挥重要作

用；恒温培养箱（Therm。FisherScient市c公司），能够精确控制温度、湿度和二氧化碳浓

度，为细胞培养提供适宜的环境；超净工作台（苏州净化设备有限公司），通过过滤空气中的

尘埃和微生物，提供一个无菌的操作环境，确保细胞培养和实验操作的无菌性。

3.2实验方法

3.2.1RNAi慢病毒载体的构建与包装

依据GenBank中SATB1基因序歹IJ（登录号”具体登录号］）,运用RNAi设计软件（如

Ambion公司的siRNATargetFindersDharmacon公司的siDESIGNCenter等）,设计针对

SATB1基因的小发夹RNA（shRNA）干扰序列。设计时遵循以下原则：干扰序列长度为19

-21个核昔酸，GC含量在30%-70%之间，避免出现连续4个以上的T或A碱基，且干扰

序列与其他基因无明显同源性。经软件分析和筛选，确定3条干扰序列，同时设计1条阴性

对照序列（不与任何已知基因序列互补），序列信息如下（表1）：

［此处插入表格1：SATB1-shRNA及阴性对照序歹ij信息］

序列名称序列（5-3）

SATB1-shRNAI［具体序列1J

SATB1-shRNA2［具体序列2］

SATB1-shRNA3［具体序列3］

NegativeControl-［具体序列4］

shRNA

将设计好的干扰序列和阴性对照序列分别合成寡核甘酸双链，两端添加相应的酶切位点（如

BamHI和EcoRI）,以便后续与慢病毒载体连接。采用化学合成法合成寡核甘酸双链，合

成过程中进行质量控制，确保序列的准确性和完整性。合成完成后，通过PAGE或HPLC对

寡核甘酸双链进行纯化，去除杂质和未反应的原料。

选用慢病毒载体（如pLVX-shRNA2载体），该载体含有绿色荧光蛋白（GFP）基因和瞟吟

霉素抗性基因，便于后续对转染细胞的筛选和鉴定。用限制性内切酶BamHI和EcoRI对慢

病毒载体进行双酶切，酶切体系为：10xBuffer5FjL,载体DNA（Ipg/pL）1pg,BamHI

1pL.EcoRHpL,ddHzO补足至50比。将酶切体系置于37℃水浴锅中孵育2・3小时,

使载体充分酶切。酶切结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收线性化

的载体片段。回收过程严格按照试剂盒说明书进行操作，确保回收的载体片段纯度和浓度满

足后续实验要求。

将纯化后的寡核昔酸双链与线性化的慢病毒载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应。

连接体系为：10xT4DNALigaseBuffer2PL线性化载体DNA50-100ng,寡核昔酸双链

100-200ng,T4DNALigase1|jL,ddH2。补足至20pL。将连接体系置于16℃恒温金属

浴中孵育过夜，使寡核甘酸双链与载体充分连接。连接反应完成后，将连接产物转化至感受

态大肠杆菌DH5。中。将感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上解冻，取5-10心连接产

物加入到100也感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。然后将混合物置于42°（:水浴锅中

热激90秒，迅速转移至冰上冷却2-3分钟。向管中加入900PL无抗LB培养基，37℃、

220rpm振荡培养1小时，使细菌恢复生长。将培养后的菌液均匀涂布在含有氨羊青霉素

dOOpg/mL）的LB固体培养基平板上，37°（:倒置培养12-16小时，待菌落长出。

从平板上挑取单菌落，接种到含有氨节青霉素的LB液体培养基中，37。&220rpm振荡培养

过夜°提取质粒DNA,采用PCR和双酶切鉴定的方法筛选阳性克隆。PCR鉴定引物根据载

体和插入片段的序列设计，PCR反应体系为：2xTaqPCRMasterMix12.5pL,上游引物

dOpM）1pL,下游引物（10pM）1pL,质粒DNA"L,ddH?O补足至25pL。PCR反应

条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55-60件退火30秒,72℃延伸1-2分钟，

共30-35个循环；72℃终延伸10分钟。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现

预期大小的条带，则初步判断为阳性克隆。对初步鉴定为阳性的克隆进行双酶切鉴定，酶切

体系和条件同载体酶切步骤。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，若出现线性化载体片段和插

入片段，则确定为阳性克隆。将阳性克隆送测序公司进行测序验证，测序结果与设计的干扰

序列一致，表明RNAi慢病毒载体构建成功。

将构建成功的RNAi慢病毒载体（pLVX-SATB1-shRNA）与包装质粒（psPAX2和

PMD2G）共转染至293T细胞中进行病毒包装。转染前1天，将293T细胞接种于6孔板

中，每孔接种1x106个细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2

培养箱中培养，使细胞在转染时达到70%-80%融合度。转染当天，按照Lipofectamine

3000转染试剂说明书进行操作o取1.5pgpLVX-SATB1-shRNA、1pgpsPAX2和0.5pg

PMD2G质粒DNA,分别加入到100pLOpti-MEM培养基中，轻轻混匀。另取5PL

Lipofectamine3000试剂加入到100pLOpti-MEM培养基中,轻轻混匀,室温孵育5分

钟。然后将稀释后的质粒DNA与稀释后的Lipofectamine3000试剂混合，轻轻混匀，室温

孵育20分钟，形成转染复合物。将转染复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇匀，置于

37℃、5%CO2培养箱中培养。转染6-8小时后，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养

基，继续培养48-72小时c收集含有病毒的上清培养液，4℃、3000rpm离心10分钟，去

除细胞碎片。将上清液通过0.45pm滤器过滤，进一步去除杂质。采用超速离心法或病毒浓

缩试剂盒对病毒上清进行浓缩，将浓缩后的病毒液分装至无菌离心管中，-80℃保存备用。

采用实时荧光定量PCR法或TCID5o法测定病毒滴度，确保病毒滴度达到实验要求。实时

荧光定量PCR法测定病毒滴度的原理是通过检测病毒基因组中特定基因的拷贝数来确定病毒

滴度。具体操作步骤为：提取病毒基因组DNA,设计针对病毒基因组特定基因的引物和探

针，进行实时荧光定量PCR反应。根据标准曲线计算出病毒基因组拷贝数，进而换算出病毒

滴度。TCI）°法测定病毒滴度的原理是将病毒液进行系列稀释，接种到敏感细胞中，观察

细胞病变效应，根据Reed-Muench法计算出病毒滴度，具体操作步骤为：将病毒液进行

10倍系列稀释，每个稀释度接种多个孔的敏感细胞，培养一定时间后，观察细胞病变效应。

记录每个稀释度出现细胞病变效应的孔数，根据Reed-Muench法计算出TCIDs。值，进而

换算出病毒滴度。

3.2.2细胞培养与转染

人乳腺癌Mcf-7细胞株在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100kig/mL链霉

素的DMEM高糖培养基中培养。将细胞置于37℃、5%COz的恒温培养箱中，定期更换培

养基，当细胞融合度达到8C%-90%时进行传代。传代时，弃去旧培养基，用PBS缓冲液

清洗细胞2-3次，加入适量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-3分钟，

待细胞变圆并开始脱落时，加入含10%FBS的DMEM培养基终止消化。用吸管轻轻吹打细

胞，使其成为单细胞悬液，然后按照1:3-1:5的比例将细胞接种到新的培养瓶中，补充适量

培养基，继续培养。

取对数生长期的Mcf-7细胞，以每孔5x104个细胞的密度接种于24孔板中，加入1mL含

10%FBS的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。转染前

2小时，更换为无血清无抗生素的DMEM培养基。将空包病毒（作为阴性对照）和重组慢病

毒（LV-SATB1-shRNA）分别用无血清无抗生素的DMEM培养基稀释至适当浓度，按照感

染复数（MOI）为50的比例加入到24孔板中，同时加入终浓度为8pg/mL的聚凝胺

（Polybrene）,轻轻混匀。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育8小时后，更换为

含10%FBS的DMEM培养基，继续培养。

转染48小时后，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，以评估转染

效率。当GFP阳性细胞比例达到80%以上时，说明转染成功。随后，向培养基中加入终浓

度为2pg/mL的喋吟霉素进行筛选，每2-3天更换一次含有喋吟霉素的培养基，持续筛选2

-3周，直至未转染的细胞全部死亡，获得稳定转染的细胞株。将稳定转染的细胞株扩大培

养，冻存于液氮中备用。在冻存细胞时，先将细胞用含10%DMSO和20%FBS的DMEM

培养基重悬，调整细胞密度为1x106・5x106个加|_,然后将细胞悬液分装至冻存管中，每

管1mL。将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，次日转移至液氮中保存。

3.2.3实时荧光定量PCR检测基因表达

采用TRIzol试剂提取各组细胞（未转染的Mcf-7细胞、转染空包病毒的Mcf-7细胞、转染

重组慢病毒的Met-7细胞）的总RNA。具体操作如下：弃去细胞培养基，用预冷的PBS缓

冲液清洗细胞2-3次，每孔加入1mLTRIzol试剂，室温静置5分钟，使细胞充分裂解。将

细胞裂解液转移至1.5mL离心管中，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分

钟。4℃、12000rpm离心15分钟，此时溶液分为三层，上层为无色水相，含有RNA;中层

为白色蛋白层；下层为红色酚氯仿相。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入等体积

的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟。4°C、12000rpm离心10分钟，离心后管底出现

白色RNA沉淀，弃去上清液。加入1mL75%乙醇(用DEPC水配制)，轻轻颠倒离心

管，洗涤RNA沉淀，4℃,7500rpm离心5分钟，弃去上清液。将离心管置于超净工作台

中，室温晾干RNA沉淀5-10分钟，待沉淀表面无明显液体残留后，加入适量DEPC水溶

解RNA,轻轻吹打使RNA完全溶解。用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求

A26o/A28o比值在L8-2.0之间。

取1pg总RNA,按照逆转录试剂富说明书进行逆转录反应，将RNA逆转录为CDNA。反应

体系如下:5xPrimeScriptBuffer4pL,PrimeScriptRTEnzymeMixI1pL,OligodTPrimer

(50pM)1pL,Random6mers(100pM)1pL,总RNA1pg,RNase-freedH?O补足

至20pL。将反应体系轻轻混匀，37℃孵育15分钟，85℃加热5秒，使逆转录酶失活，4℃

保存备用。

根据GenBank中Wnt信号通路相关基因(如Wnt1、p-catenin,TCF4等)以及内参基因

GAPDH的序列，使用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物序列由生工生物工程(上海)

股份有限公司合成。引物序列信息如下(表2):

［此处插入表格2:实时荧光定量PCR引物序列信息］

基因名称引物序列(5-3')扩增片段长度(bp)

Wnt1F:［具体序列5］R:［具体［具体长度1］

序列6］

p-cateninF:［具体序列7］R:［具体［具体长度2］

序列8］

TCF4F:［具体序列9］R:［具体