SARS相关冠状病毒小鼠感染模型构建及致病性的深度剖析

SARS相关冠状病毒小鼠感染模型构建

及致病性的深度剖析

一、引言

1.1研究背景

SARS相关冠状病毒(SARS-relatedcoronavirus)作为一类具有高度致病性的病毒，曾在21

世纪初引发严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS)的全球性爆

发，给人类健康和社会经济带来了沉重打击。SARS疫情的爆发，在短短几个月内迅速蔓延至

全球30多个国家和地区，累计感染人数超过8000人，死亡率高达约10%,引起了全球范围

内的广泛关注和恐慌。虽然SARS疫情最终得到了有效控制，但SARS相关冠状病毒的潜在

威胁依然存在，对其进行深入研究具有至关重要的意义。

在病毒学研究领域，动物模型是不可或缺的工具，对于深入探究SARS相关冠状病毒的致病

机制、传播途径、宿主免疫反应以及评估疫苗和药物的有效性等方面发挥着关键作用,通过建

立合适的动物模型，研究人员能够在可控的实验条件下模拟病毒感染过程，观察病毒与宿主之

间的相互作用，从而揭示病毒的致病机理，为开发有效的防控策略提供理论依据。

小鼠作为一种常用的实验动物，具有繁殖周期短、饲养成本低、遗传背景清晰等诸多优点，在

病毒感染模型的构建中被广泛应用。然而，由于小鼠与人类在生理结构和免疫反应等方面存在

一定差异，野生型小鼠对SARS相关冠状病毒通常不易感，这给小鼠感染模型的构建带来了

挑战。因此，如何构建有效的SARS相关冠状病毒小鼠感染模型，使其能够准确模拟人类感

染的病理过程和免疫反应，成为了本研究的关键问题。

1.2研究目的与意义

本研究旨在构建一种高效、稳定的SARS相关冠状病毒小鼠感染模型，深入研究该病毒在小

鼠体内的致病性，包括病毒感染后的病理变化、免疫反应以及病毒的传播特性等。通过该模

型，进一步探究SARS相关冠状病毒的致病机制，为理解病毒与宿主之间的相互作用提供重

要的实验依据。具体来说，本研究期望达到以下目的：一是通过对小鼠进行基因编辑或采用特

定的病毒株，建立能够稳定感染SARS相关冠状病毒的小鼠模型，模拟人类感染的病理过

程；二是利用建立的小鼠感染模型，系统研究SARS相关冠状病毒在小鼠体内的致病性，包

括病毒的组织嗜性、病理损伤特征以及免疫反应的动态变化；三是分析SARS相关冠状病毒

感染小鼠后引起的细胞因子风暴、免疫细胞活化与功能变化等免疫病理机制，为开发有效的免

疫治疗策略提供理论基础。

构建SARS相关冠状病毒小鼠感染模型并研究其致病性具有重要的理论和实际意义。从理论

层面来看，深入了解SARS相关冠状病毒的致病机制是病毒学研究的核心内容之一。通过小

鼠感染模型，研究人员可以在严格控制的实验条件下，对病毒的感染过程、致病机制以及宿主

的免疫反应进行深入研究，揭示病毒与宿主之间相互作用的分子机制，填补目前在这一领域的

理论空白，为病毒学的发展提供新的理论依据。

在实际应用方面，该研究对于传染病的防控具有重要的指导意义。首先，小鼠感染模型可以作

为评估疫苗和药物有效性的重要工具。在疫苗研发过程中，利用小鼠感染模型可以快速评估疫

苗的免疫原性和保护效果，筛选出具有潜力的疫苗候选株，加速疫苗的研发进程。对于约物

研发，小鼠感染模型可以用于测试药物的抗病毒活性、安全性和药代动力学特性，为临床前药

物研究提供关键数据，有助于开发出更加有效的抗病毒药物。其次，通过研究SARS相关冠

状病毒的致病性，可以为疫情的防控策略提供科学依据。了解病毒的传播途径、致病特点以及

高危人群的易感性，有助于制定针对性的防控措施，如隔离、疫苗接种策略以及公共卫生干预

措施等，提高疫情防控的效果，减少疾病的传播和扩散，保护公众健康。此外，建立SARS

相关冠状病毒小鼠感染模型还可以为未来可能出现的类似疫情提供应对预案，增强人类对新发

传染病的应对能力。

二、SARS相关冠状病毒概述

2.1病毒结构与分类

SARS相关冠状病毒属于冠状病毒科（Coronaviridae）,是一类具有囊膜的正链单股RNA病

毒，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的。这类病毒的粒子形状并不规则，多呈圆形或椭圆

形，常为多形性，直径约60-220nm0病毒粒子具有包膜结构，这层包膜在病毒的感染过程中

起着重要作用，它能够帮助病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击，同时也参与了病毒与宿主细

胞的结合和融合过程。

在病毒的包膜上，存在着三种重要的蛋白，分别是刺突糖蛋白（Spikeprotein,S蛋白）、膜

蛋白（Membraneprotein,M蛋白）和包膜蛋白（Envebpeprotein,E蛋白）。其中，S蛋

白尤为关键，它是病毒的主要抗原成分，也是病毒与宿主细胞受体结合的部位。S蛋白呈棒状

结构，从病毒包膜表面向外突出，形如日冕，这也是冠状病毒名称的由来。S蛋白的结构高度

复杂，包含多个功能域，其中受体结合域（Receptor-bindingdomain,RBD）能够特异性地

与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，从而介导病毒进入宿主细胞。这

种特异性的结合是病毒感染宿主的第一步，也是决定病毒宿主范围和组织嗜性的关键因素0M

蛋白是一种膜糖蛋白，它在病毒的出芽和包膜形成过程中发挥着重要作用，参与维持病毒粒子

的结构稳定性。E蛋白则相对较小，虽然其具体功能尚未完全明确，但研究表明它可能与病

毒的组装、释放以及致病性等方面有关。

此外，病毒粒子内部还包含核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,N蛋白）和病毒的遗传物质

RNA。N蛋白与病毒RNA紧密结合，形成核衣壳结构，对病毒RNA起到保护作用，确保其

在宿主细胞内的稳定复制和转录。

在分类学上，冠状病毒科又分为冠状病毒亚科(Coronavirinae)和环曲病毒亚科

(Torovirinae)。我们通常所说的冠状病毒指的是冠状病毒亚科成员。冠状病毒亚科进一步

分为a、B、Y和b四个属，其中。和B属主要感染哺乳动物，包括人类，而Y和6属多感

染禽类。SARS相关冠状病毒属于0属冠状病毒，在B属冠状病毒中，又可细分为多个亚

型，SARS相关冠状病毒属于其中的Sarbecovirus亚型，且该亚型下包含多种病毒，如引发

2003年非典疫情的SARS冠状病毒(SARS-CoV)以及与新冠疫情相关的SARS-CoV-2

等。这些病毒在基因序列、蛋白结构以及生物学特性等方面存在一定的相似性和差异性，对

它们的深入研究有助于我们更好地理解冠状病毒的进化、传播和致病机制。

2.2病毒传播与致病机制

SARS相关冠状病毒的传播途径主要包括近距离呼吸道飞沫传播、密切接触传播以及气溶胶传

播等。在近距离呼吸道飞沫传播方面，当感染者咳嗽、打喷嚏或说话时，会产生含有病毒的

飞沫，这些飞沫可以在空气中短距离传播，被周围的人吸入后，就有可能导致感染o密切接

触传播则是指与感染者直接接触，如触摸感染者的口鼻分泌物，或者间接接触被病毒污染的物

品，如毛巾、衣物、餐具等，然后再触摸自己的口鼻眼等部位，从而使病毒进入体内。气溶

胶传播是指病毒在空气中形成气溶胶，这些气溶胶可以在空气中长时间悬浮，并随着空气流动

传播，当健康人吸入含有病毒的气溶胶时，就可能被感染。研究表明，在一些通风不良、人

员密集的场所，如医院病房,公共交通工具等，气溶胶传播的风险相对较高。

病毒感染人体的过程是一个复杂的分子机制。首先，病毒表面的S蛋白与宿主细胞表面的受

体血管紧张素转化酶2(ACE2)特异性结合。这种结合是高度特异性的，ACE2在人体的呼

吸道、胃肠道、心血管系统等多个组织和器官的细胞表面广泛表达，这也解释了SARS相关

冠状病毒为何能够感染多个器官系统。S蛋白的受体结合域(RBD)与ACE2的结合，就像

一把钥匙插入对应的锁孔，开启了病毒进入细胞的大门。一旦结合成功，病毒包膜与宿主细

胞膜发生融合，病毒的遗传物质RNA被释放到宿主细胞为。

进入细胞后，病毒利用宿主细胞的代谢系统进行自身的复制和转录。病毒的RNA首先被翻译

成多聚蛋白，这些多聚蛋白会被病毒自身编码的蛋白酶切割成多个具有功能的非结构蛋白，如

RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)等。RdRp在病毒的复制过程中起着核心作用，它以病毒

RNA为模板，合成大量的子代病毒RNA。同时，病毒还会利用宿主细胞的核糖体合成病毒

的结构蛋白，如S蛋白、M蛋白、N蛋白等。这些结构蛋白和子代病毒RNA在宿主细胞内

组装成新的病毒粒子，然后通过出芽的方式释放到细胞外，继续感染周围的细胞。

在病毒感染人体后，会引发一系列的免疫反应，这也是导致疾病发生的重要因素。当免疫系

统识别到病毒入侵时，会启动先天性免疫反应。先天性免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞

等，会吞噬病毒并释放细胞因子和趋化因子，招募其他免疫细胞到感染部位。然而，在一些

严重感染的病例中，过度的免疫反应会导致细胞因子风暴的发生。细胞因子风暴是指机体免

疫系统过度激活，大量释放细胞因子，如白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子。(TNF-a)

等。这些细胞因子会引起全身炎症反应，导致血管内皮细胞损伤、肺水肿、呼吸衰竭等严重

的病理变化，是SARS患者病情恶化和死亡的重要原因之一。

随着感染的持续，适应性免疫反应也会逐渐启动。T淋巴细胞和B淋巴细胞被激活，T淋巴

细胞可以直接杀伤被病毒感染的细胞，或者辅助B淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞产生的特

异性抗体可以中和病毒，阻止病毒进一步感染细胞。然而，在某些情况下，病毒可能会通过

变异等方式逃避免疫系统的识别和攻击，导致感染的持续和病情的反复。

三、小鼠感染模型构建策略

3.1直接感染近交系小鼠

3.1.1实验小鼠选择

在构建SARS相关冠状病毒小鼠感染模型时，近交系小鼠是常用的实验动物，其中BALB/c

和C57BL/6小鼠尤为典型。BALB/c小鼠是一种白色、免疫反应较为敏感的近交系小鼠。其

免疫系统对病原体的刺激反应强烈，在感染SARS相关冠状病毒后，能够产生明显的免疫应

答。例如，研究表明，BALB/c小鼠感染病毒后，体内的T淋巴细胞和B淋巴细胞会迅速活

化，产生大量的细胞因了和抗体。这使得研究人员能够较为容易地观察和检测到病毒感染引

发的免疫反应变化，为研究病毒与免疫系统的相互作用提供了便利。此外，BALB/c小鼠的繁

殖性能良好，产仔数量较多，饲养成本相对较低，这使得在大规模实验中能够提供充足的实验

样本。

C57BL/6小鼠则是一种黑色的近交系小鼠，其遗传背景稳定，在免疫学、神经科学等多个领

域都有广泛应用。在SARS相关冠状病毒感染研究中，C57BL/6小鼠具有独特的优势。它对

多种病原体的感染表现出相对稳定的反应，其体内的免疫细胞亚群分布和功能具有一定的特

征，这有助于研究人员深入探究病毒感染后的免疫调节机制。例如，C57BL/6小鼠感染病毒

后，其肺部的炎症反应相对线为规律，便于观察和分析病毒感染对肺部组织的损伤以及炎症发

展的过程。同时，由于C57BL/6小鼠在遗传学研究方面的广泛应用，其基因数据库较为完

善，这为从基因层面研究病毒感染机制提供了有力的支持。

选择这两种近交系小鼠进行SARS相关冠状病毒感染实验，还考虑到它们在以往的病毒感染

研究中积累了丰富的研究数据和经验。研究人员对它们的生理特性、免疫反应特点以及对各种

实验处理的耐受性等方面都有较为深入的了解，这使得在实验设计和结果分析时能够更好地进

行把控和解释。此外，它们的体型适中，便于进行各种实验操作，如病毒接种、血液采集、

组织取样等。然而，野生型的BALB/c和C57BL/6小鼠对SARS相关冠状病毒的天然易感性

较低，这就需要通过一些特殊的实验手段来提高它们对病毒的敏感性，从而建立有效的感染模

型。

3.1.2感染方法与过程

在直接感染近交系小鼠的实验中，鼻腔接种是一种常用的病毒接种方式。鼻腔接种能够使病

毒直接接触小鼠的呼吸道黏膜，模拟病毒在自然感染过程中通过呼吸道传播的途径。具体操

作时，首先需要将SARS相关冠状病毒制备成合适浓度的病毒悬液。病毒悬液的浓度需要根

据实验目的和前期预实验的结果进行精确调整，一般来说，常用的病毒滴度范围在10M-

10A6PFU(空斑形成单位)/mL之间。

在接种前，需要将小鼠进行适当的麻醉，以确保接种过程的顺利进行和小鼠的安全。常用的

麻醉方法包括腹腔注射戊巴比妥钠或异氟烷吸入麻醉等。麻醉后的小鼠被放置在一个特制的

操作台上，头部固定，使其鼻孔朝上。然后，使用微量移液器吸取适量的病毒悬液，一般每

侧鼻孔接种的体积为5-20口1,。将移液器的tip轻轻靠近小鼠的鼻孔，缓慢将病毒悬液滴入

鼻孔内。在滴入过程中，需要注意控制滴速，避免病毒悬液过快进入鼻腔导致小鼠呛咳或病

毒悬液流出鼻腔。滴入完成后，轻轻按摩小鼠的鼻部，以促进病毒悬液在鼻腔内的扩散。

接种时间也是实验中的一个重要因素。一般在接种后的不同时间点，如1天、3天、5天、7

天等，对小鼠进行观察和检测。观察内容包括小鼠的临庆症状，如精神状态、活动能力、饮

食情况、体重变化等。同时，在不同时间点采集小鼠的血液、鼻腔洗液、肺组织等样本，用

于检测病毒载量、免疫指标和病理变化等。例如，通过实时荧光定量PCR技术检测血液和组

织样本中的病毒核酸含量，了解病毒在小鼠体内的复制情况；通过酶联免疫吸附测定

(ELISA)方法检测血清中的细胞因子水平，分析病毒感染引发的免疫反应；对肺组织进行

病理切片和染色，观察肺部的病理损伤特征。

3.1.3模型特点与局限性

这种直接感染近交系小鼠的模型在病毒复制和致病表现上具有一定的特点。在病毒复制方

面，感染初期，病毒能够在小鼠的鼻腔和呼吸道黏膜上皮细胞内迅速复制。随着感染时间的

延长，病毒载量在肺部等组织中逐渐升高，引发肺部的炎症反应。在致病表现上，感染小鼠

会出现一系列类似于人类感染SARS相关冠状病毒后的症状，如体重减轻、精神萎靡、呼吸

急促等。病理检查可见肺部出现间质性肺炎，表现为肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润、肺泡腔

内渗出等病理变化。

然而，该模型也存在一些局限性，在模拟人类感染方面存在一定的不足。由于小鼠与人类在

生理结构和免疫反应上存在差异，小鼠感染后的症状和病理变化与人类感染仍有一定的差

距。例如，人类感染SARS相关冠状病毒后，除了呼吸系统症状外，还可能出现消化系统、

心血管系统等多系统的症状，而小鼠感染模型中这些系统的症状相对不明显。此外，小鼠的

免疫系统对病毒的反应速度和强度与人类也有所不同，这可能导致在研究病毒与免疫系统相互

作用时，结果不能完全准确地反映人类的情况。野生型近交系小鼠对SARS相关冠状病毒的

易感性相对较低，需要较高滴度的病毒才能成功感染，这与人类自然感染的情况也存在差

异。在实际应用中，需要综合考虑这些局限性，结合其他研究方法和模型，以更全面、准确

地研究SARS相关冠状病毒的致病机制和防控策略。

3.2基因编辑小鼠技术

3.2.1hACE2转基因小鼠构建

构建hACE2转基因小鼠的核心原理是利用基因工程技术，将人ACE2基因导入小鼠基因组

中，使其在小鼠体内稳定表达人源的ACE2蛋白。由于小鼠自身的ACE2蛋白与SARS相关

冠状病毒的结合能力较弱，而人ACE2蛋白能够与病毒表面的S蛋白特异性结合，从而介导

病毒进入细胞。通过将人ACE2基因转入小鼠，使得小鼠细胞表面能够表达具有病毒结合活

性的ACE2蛋白，进而增加小鼠对SARS相关冠状病毒的易感性。

在构建过程中，常用的方法是将人ACE2基因与特定的启动子连接，然后通过显微注射技术

将重组基因导入小鼠受精卵的原核中。启动子在基因表达调控中起着关键作用，不同的启动

子具有不同的组织特异性和表达强度。例如，细胞角蛋白18(K18)启动子是一种上皮细胞

特异性启动子。将人ACE2基因置于K18启动子的控制下，能够使hACE2在小鼠的上皮细

胞中特异性表达。由于呼吸道上皮细胞是SARS相关冠状病毒感染的主要靶细胞之一，K18

启动子驱动的hACE2转基因小鼠能够在呼吸道上皮细胞高效表达hACE2,从而模拟病毒在

人体呼吸道的感染过程。研究表明，K18-hACE2转基因小鼠感染SARS相关冠状病毒后，

病毒能够在呼吸道上皮细胞内大量复制，引起明显的呼吸道症状和病理变化O

CAG启动子则是一种广泛表达的启动子，它由巨细胞病毒(CMV)早期增强子、鸡0-肌动

蛋白启动子和兔P-珠蛋白polyA信号序列组成。使用CAG启动子驱动人ACE2基因表达，

能够使hACE2在小鼠的多种组织和器官中广泛表达。这种广泛表达的特性使得研究人员可以

观察病毒在多个组织和器官中的感染和致病情况，全面了解病毒的组织嗜性和全身致病性。

在CAG+ACE2转基因小鼠感染实验中，不仅在呼吸道，在肝脏、肾脏、心脏等器官中也检

测到了病毒的复制和感染，为研究病毒感染引起的多器官损伤提供了有力的模型。

小鼠ACE2基因启动子也是常用的启动子之一。它能够驱动人ACE2基因在小鼠原本表达

ACE2的细胞和组织中表达，保持了ACE2表达的天然模式。与其他启动子相比，使用小鼠

ACE2基因启动子构建的hACE2转基因小鼠，其hACE2的表达更接近小鼠自身ACE2的表

达情况，这有助于研究病毒感染过程中，人源ACE2在小鼠体内正常生理环境下的作用机

制。利用该启动子构建的转基因小鼠，在研究病毒与宿主细胞相互作用的分子机制时，能够

提供更真实的实验数据。

3.2.2其他基因修饰策略

除了构建hACE2转基因小鼠外，敲除或修饰其他相关基因也可以影响小鼠对SARS相关冠状

病毒的感染易感性和致病性。例如，敲除小鼠体内的某些免疫相关基因，可能会改变小鼠的

免疫反应，从而影响病毒的感染和致病过程。研究发现，敲除Toll样受体3(TLR3)基因的

小鼠，对SARS相关冠状病毒的易感性明显增加。TLR3是一种重要的模式识别受体，能够

识别病毒双链RNA,激活先天性免疫反应。当TLR3基因被敲除后，小鼠的先天性免疫反应

受到抑制，无法及时有效地识别和清除病毒，导致病毒在小鼠体内大量复制，病情加重。这

表明TLR3在小鼠抵抗SARS相关冠状病毒感染中发挥着重要作用，敲除该基因可以作为一

种研究病毒感染与免疫逃逸机制的策略。

对小鼠的细胞因子基因进行修饰也具有重要意义。细胞因子在免疫调节和炎症反应中起着关

键作用。通过基因编辑技术，上调或下调某些细胞因子的表达，能够改变小鼠体内的免疫微

环境，影响病毒的感染和致病进程。有研究尝试下调小鼠体内白细胞介素6(IL-6)的表

达。在SARS相关冠状病毒感染过程中，IL-6的过度表达会引发细胞因子风暴，导致严重的

炎症反应和组织损伤。下调IL-6表达后，小鼠感染病毒后的炎症反应明显减轻，肺部病理损

伤也有所改善。这说明通过修饰细胞因子基因，可以调节小鼠的免疫反应，减轻病毒感染引

起的病理损伤，为研究病毒感染的免疫病理机制和开发免疫治疗策略提供了新的思路。

3.2.3基因编辑模型优势

基因编辑小鼠模型在研究病毒与宿主相互作用方面具有独特的优势。从遗传背景的角度米

看，基因编辑小鼠的遗传背景明确且可控。研究人员可以精确地对小鼠的特定基因进行编

辑，使其表达或缺失特定的基因产物。与传统的近交系小鼠直接感染模型相比，基因编辑小

鼠模型能够更准确地模拟人类感染的遗传背景。在hACE2转基因小鼠中，通过导入人源

ACE2基因，使得小鼠在遗传水平上具备了与人类相似的病毒受体，从而更真实地模拟了

SARS相关冠状病毒感染人类的过程。这种精确的遗传模拟有助于研究人员深入探究病毒与

宿主细胞表面受体结合的分子机制，以及病毒感染后在宿主细胞内的复制、转录和翻译等过

程。

基因编辑小鼠模型还能够实现对病毒感染和致病过程的精细调控。通过编辑不同的基因，研

究人员可以分别研究各个基因在病毒感染过程中的作用。例如，在敲除免疫相关基因的小鼠

模型中，可以观察到免疫反应的缺失对病毒感染和致病的影响；在修饰细胞因子基因的小鼠模

型中，可以研究细胞因子在免疫调节和炎症反应中的具体作用。这种对病毒感染和致病过程

的精细调控，使得研究人员能够从多个角度深入研究病毒与宿主的相互作用，揭示病毒感染的

分子机制和免疫病理机制。

基因编辑小鼠模型在研究病毒与宿主相互作用方面具有高度的特异性和可控性，能够为深入理

解SARS相关冠状病毒的致病机制提供有力的实验工具，也为开发针对该病毒的防控策略和

治疗方法奠定了坚实的基础。

3.3病毒适应进化

3.3.1适应进化原理与方法

病毒适应进化的核心原理是基于自然选择和遗传变异的理论。当SARS相关冠状病毒在小鼠

体内进行连续传代时，病毒面临着小鼠体内独特的环境压力，包括小鼠的免疫系统、细胞表面

受体的差异以及细胞内的代谢环境等。在这种选择压力下，病毒的基因组会发生随机突变。

这些突变可能导致病毒蛋白的氨基酸序列改变，进而影响病毒的生物学特性，如病毒与小鼠细

胞受体的结合能力、病毒的复制效率、免疫逃逸能力等。那些能够更好地适应小鼠宿主环境

的突变病毒，具有更强的生存和繁殖优势，在连续传代过程中逐渐被选择和保留下来，从而使

病毒逐渐适应小鼠宿主。

在具体操作过程中，首先需要获取合适的SARS相关冠状病毒临床株或实验室保存株。将该

病毒株通过易腔接种等方式感染小鼠。在感染后的特定时间点，如感染后3-5天，米集小鼠

的肺组织、鼻腔分泌物等样本。从这些样本中提取病毒，进行病毒的分离和培养，获得子代

病毒。然后，将子代病毒再次感染新的小鼠，重复上述过程，进行多轮连续传代。在传代过

程中，需要密切观察小鼠的I备床症状，记录小鼠的体重变化、精神状态、呼吸频率等指标。

同时，定期采集小鼠的组织样本，检测病毒载量和病毒的遗传变异情况。通过分析不同传代

病毒的生物学特性和遗传信息，筛选出在小鼠体内适应性良好、致病力较强的病毒株。

3.3.2适应毒株筛选与鉴定

筛选致病性更强的适应毒株需要综合考虑多个因素。在临床症状方面，选择感染后能导致小

鼠出现明显症状的病毒株。例如，那些使小鼠体重迅速下降，体重下降幅度超过15%-20%

的病毒株，可能具有更强的致病性。小鼠出现精神萎靡、活动明显减少、呼吸急促甚至呼吸

困难等症状，也表明病毒株对小鼠的影响较大。

病毒载量也是一个重要的筛选指标。通过实时荧光定量PCR等技术，检测感染小鼠不同组织

中的病毒核酸含量。选择在肺组织、肝脏、脾脏等重要器官中病毒载量较高的病毒株。例

如，在感染后第5天，肺组织中病毒载量达到10A6-10，，7copies/g以上的病毒株，可能具有

更强的复制能力和致病性O

遗传特征分析对于筛选适应毒株也至关重要o对不同传代病毒的基因组进行测序，分析病毒

基因组中的突变位点。关注那些与病毒受体结合、复制酶活性、免疫逃逸等功能相关基因的

突变。如S蛋白基因中的突变可能影响病毒与小鼠细胞受体的结合能力，若突变导致病毒与

小鼠细胞受体的亲和力增强，则该病毒株可能更具致病性。

鉴定适应毒株的特征时，除了上述的遗传特征分析外，还需要进行病毒的生物学特性鉴定。

包括测定病毒的感染滴度，通过空斑实验等方法确定病毒在细胞培养中的感染能力。研究病

毒的宿主范围，检测适应毒株是否能够感染其他种类的小鼠或动物细胞.以了解其感染特异性

的变化。通过蛋白质免疫印迹(Westernblot)等方法，分析病毒蛋白的表达和修饰情况，进

一步了解病毒在适应过程中的变化。

3.3.3适应进化模型意义

适应进化模型在研究病毒进化和致病机制方面具有不可替代的重要意义。从病毒进化的角度

来看，该模型为研究病毒在新宿主环境中的进化规律提供了直观的实验体系。通过连续传代

观察病毒的变异和进化过程，研究人员可以深入了解病毒如何通过基因突变来适应新的宿主，

以及这些突变对病毒生物学恃性的影响。这有助于预测病毒在自然界中的进化方向，为预防

病毒跨物种传播和新疫情的爆发提供理论依据。例如，通过分析适应毒株的突变特征，研究

人员可以发现病毒在适应小鼠宿主过程中哪些基因更容易发生突变，这些突变是否会增加病毒

对其他物种的感染风险等。

在致病机制研究方面，适应进化模型能够帮助研究人员更深入地探究病毒在小鼠体内的致病过

程。与野生型病毒感染相比，适应毒株在小鼠体内可能引发更明显的病理变化和免疫反应。

通过对感染适应毒株小鼠的病理切片分析、免疫细胞功能检测等研究，可以揭示病毒感染导致

组织损伤、免疫失衡的具体机制。这对于理解SARS相关冠状病毒的致病机理，开发针对性

的治疗策略具有重要的指导作用。通过研究适应毒株感染小鼠后引发的细胞因子风暴的发生

机制和调控途径，为开发抑制细胞因子风暴的药物提供理论基础。适应进化模型还可以用于

评估疫苗和药物对适应毒株的有效性，为疫苗和药物的研发提供更贴近实际感染情况的实验模

型。

四、小鼠感染模型致病性研究

4.1临床症状观察

4.1.1症状表现与时间进程

在SARS相关冠状病毒感染小鼠后，体重变化是一个重要的观察指标。感染初期，小鼠体重

可能无明显变化，但随着感染的进展，通常在感染后3-5天，部分小鼠开始出现体重下降的

情况。以感染适应毒株的BALB/c小鼠为例，在感染后第3天，体重平均下降约5%,到第

5天，体重下降幅度可达10%-15%。这种体重下降主要是由于病毒感染导致小鼠食欲减

退，能量摄入减少，同时病毒感染引发的炎症反应也会增加机体的能量消耗。

精神状态的改变也是感染小鼠的典型症状之一。感染后，小鼠精神萎靡，活动明显减少。原

本活泼好动的小鼠，变得嗜睡，对周围环境的刺激反应迟钝。在感染早期，小鼠可能只是活

动频率降低，如在饲养笼内的走动次数减少，而到了感染后期，小鼠可能会长时间蜷缩在角

落，几乎不进行自主活动。

呼吸系统症状同样显著，许多感染小鼠会出现呼吸急促的症状。在感染后4-6天，呼吸频率

明显加快，相较于正常小鼠每分钟160-210次的呼吸频率，感染小鼠的呼吸频率可增加至

每分钟250-300次。部分病情严重的小鼠，还可能出现呼吸困难，表现为呼吸时腹部起伏

明显，甚至出现鼻翼煽动的情况。这是因为病毒感染导致肺部炎症，肺泡受损，气体交换功

能障碍，从而影响了呼吸系统的正常运作。

毛发状态也会发生变化。感染小鼠的毛发变得粗糙、无光泽，且容易出现竖毛现象。正常小

鼠的毛发顺滑，而感染后的小鼠毛发杂乱，竖毛可能是由于病毒感染引发的应激反应，导致交

感神经兴奋，引起立毛肌收缩。

4・1.2不同模型症状差异

不同构建策略的小鼠感染模型在临床症状上存在明显差异。在直接感染近交系小鼠模型中，

由于野生型近交系小鼠对SARS相关冠状病毒的易感性相对较低，即使感染成功，其症状相

对较轻。体重下降幅度一般在感染后7-10天较为明显，且下降幅度通常在10%以内。精

神状态改变也相对不明显，呼吸急促等症状出现的时间较晚，且程度较轻。这主要是因为小

鼠自身的免疫系统能够在一定程度上抵御病毒的感染，限制病毒的复制和传播。

基因编辑小鼠模型，如hACE2转基因小鼠，症状则较为严重。由于其细胞表面表达人源

ACE2蛋白，增加了对病毒的易感性。感染后，体重下降迅速，在感染后2-3天就可能出现

明显的体重下降，下降幅度可达15%-20%。精神萎靡症状在感染后很快出现，呼吸急促等

呼吸系统症状也更为明显，且可能更早出现呼吸困难的症状。这是因为病毒能够更有效地进

入细胞并进行复制，引发更硬烈的免疫反应和组织损伤。

病毒适应进化模型中，感染适应毒株的小鼠症状介于上述两者之间。体重下降在感染后4・5

天较为明显，下降幅度约为10%-15%。精神状态和呼吸症状的表现也较为明显，但相对于

基因编辑小鼠模型，症状的严重程度稍轻。这是因为适应毒株虽然在小鼠体内具有更好的适

应性和致病性，但与基因编辑小鼠模型中病毒与人源ACE2的特异性结合相比，其感染机制

和致病过程仍存在一定差异。

4.2病理变化分析

4.2.1肺部病理特征

感染SARS相关冠状病毒的小鼠肺部呈现出一系列显著的病理变化。在光镜下观察，肺泡炎

是最为常见的病理改变之一。肺泡间隔明显增宽，这主要是由于炎性细胞浸润以及间质水肿

所致。炎性细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等。巨噬细胞作为先天性免疫细胞，

在病毒感染初期被激活，它们通过吞噬病毒和释放细胞因子来启动免疫反应，但同时也会引发

炎症。淋巴细胞则参与适应性免疫反应，T淋巴细胞可杀伤被病毒感染的细胞，B淋巴细胞

产生抗体，然而在感染过程中，淋巴细胞的功能可能会受到抑制，导致免疫失衡。中性粒细

胞的浸润会释放大量的炎症介质，进一步加重炎症反应。

肺泡腔内还可见渗出物，包括浆液、纤维蛋白和炎性细胞等。这些渗出物会影响肺泡的气体

交换功能，导致氧气摄入不足和二氧化碳排出障碍。在严重的病例中，肺泡腔内还可能出现

透明膜形成。透明膜主要由纤维蛋白、坏死细胞碎片和炎性渗出物组成，它的形成会进一步

阻碍气体交换，是导致呼吸衰竭的重要原因之一。

随着感染时间的延长，部分小鼠肺部可能出现肺纤维化的病理改变。肺纤维化是一种慢性的

病理过程，表现为肺部纤维结缔组织增生，正常的肺组织结构被破坏。在感染后期，由于持

续的炎症刺激和组织损伤，成纤维细胞被激活，它们大量合成和分泌胶原蛋白等细胞外基质成

分，导致肺组织纤维化。肺纤维化会使肺部的弹性降低，通气功能障碍，严重影响小鼠的呼

吸功能。研究表明，在感染后10-14天，部分小鼠的肮部开始出现轻度的纤维化，表现为肺

泡间隔内少量纤维组织增生；而在感染后21天左右，纤维化程度可能进一步加重，部分区域

可见明显的纤维条索形成。

4.2.2其他器官受累情况

除了肺部，SARS相关冠状病毒感染小鼠后，其他器官也会受到不同程度的影响。在肝脏

中，部分小鼠出现肝细胞变性，表现为肝细胞肿胀、胞质疏松，严重时可出现气球样变。这

是由于病毒感染导致肝细胞代谢紊乱，细胞内水分增多所致。部分肝细胞还可能出现坏死，

表现为细胞核固缩、碎裂或溶解。肝小叶结构也可能遭到破坏，汇管区可见炎性细胞浸润。

研究发现，在感染后5-7天，肝脏中的病毒载量达到高峰，此时肝细胞的损伤最为明显。

心脏也会出现一些病理表现。心肌细胞可能出现变性，表现为心肌细胞肿胀、横纹模糊。部

分小鼠还可能出现心肌间质水肿和炎性细胞浸润。这些病理变化会影响心脏的正常功能，导

致心肌收缩力下降，心输出量减少。在感染严重的小鼠中，可能会出现心律失常等心脏功能

异常的表现。

在大脑中，病毒感染可导致神经元变性和坏死。神经元是大脑的基本功能单位，它们的损伤

会影响大脑的正常功能。部分小鼠还会出现胶质细胞增生，胶质细胞在大脑中起到支持和营

养神经元的作用，但在病毒感染时，胶质细胞的增生可能是一种代偿性反应，也可能参与了炎

症反应和免疫调力o大脑的血管周围可见炎性细胞浸润，这可能会影响脑血管的正常功能，

导致脑供血不足等问题。

4.2.3病理变化与临床症状关联

病理变化与临床症状之间存在着密切的关联。小鼠肺部的病理变化是导致呼吸系统症状的主

要原因。肺泡炎和肺纤维化会导致肺部气体交换功能障碍，使小鼠出现呼吸急促、呼吸困难

等症状。随着肺部炎症的加重，肺泡腔内渗出物增多，进一步阻碍气体交换，导致小鼠缺

氧，从而表现出精神萎靡、活动减少等症状.

肝脏的病理变化与小鼠的全身状况密切相关o肝细胞变性和坏死会影响肝脏的代谢和解毒功

能，导致体内毒素堆积，影响小鼠的食欲和消化功能，进而导致体重下降。心脏的病理变化

会影响心脏的泵血功能，导致全身血液循环障碍，进一步加重小鼠的病情。大脑的病理变化

则可能导致小鼠出现神经系统症状，如行为异常、抽搐等。在感染后期，当大脑中的神经元

损伤严重时，小鼠可能会出现昏迷等严重的神经系统症状。通过对病理变化与临床症状的关

联研究，可以更深入地理解SARS相关冠状病毒的致病机制，为开发有效的治疗策略提供依

据。

4.3病毒载量检测

4.3.1检测方法与原理

在SARS相关冠状病毒小鼠感染模型的研究中，实时荧光定量PCR(RT-PCR)是检测病毒

载量的常用且关键的方法之一。其原理基于逆转录和聚合酶链反应技术。由于SARS相关冠

状病毒的遗传物质为RNA,首先需要利用逆转录酶将病毒的RNA逆转录为互补DNA

(CDNA)。逆转录过程中，以病毒HNA为模板，在逆转录酶的作用下，以dNIP为原料，

根据碱基互补配对原则合成CDNA。随后，针对病毒特定的基因片段设计引物和探针。引物

是一段与病毒基因片段两端序列互补的寡核昔酸，用于引导DNA聚合酶扩增目标基因片段。

探针则是一段带有荧光基团和淬灭基团的寡核昔酸，它能够特异性地与目标基因片段杂交。

在PCR扩增过程中，DNA聚合酶以cDNA为模板，在引物的引导下，不断地将dNTP添加

到引物的3端，从而实现目标基因片段的指数级扩增。随着扩增的进行，探针会被DNA聚

合酶降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。通过实时监测荧光信号的

强度变化，就可以实时反映PCR扩增的进程。在一定范围内，荧光信号的强度与起始模板

（即病毒核酸）的量成正比，因此可以通过标准曲线法对病毒载量进行定量分析。

病毒滴定也是一种重要的检测方法，其中空斑实验是常用的病毒滴定技术。其原理是基于病

毒能够在细胞培养物中形成空斑的特性。将稀释后的病毒悬液接种到长满单层细胞的培养板

上，病毒会吸附并感染细胞。在病毒感染细胞后，会在细胞内进行复制和增殖，导致被感染

的细胞发生病变、死亡。随后，在细胞培养物上覆盖一层含有营养物质和琼脂的培养基，这

样可以限制病毒的扩散，使得病毒只能感染相邻的细胞。经过一段时间的培养，被病毒感染

的细胞会逐渐死亡，形成肉眼可见的空斑。每个空斑被认为是由一个病毒粒子感染并噌殖形

成的，因此通过计数空斑的数量，并结合病毒悬液的稀释倍数，就可以计算出病毒的滴度，即

单位体积病毒悬液中所含有的感染性病毒粒子的数量。例如，若在10'6稀释度的病毒悬液

接种的培养板上，平均形成了50个空斑，那么该病毒悬液的滴度即为50x1（T6PFU/mL。

4.3.2不同组织病毒分布

在小鼠感染SARS相关冠状病毒后，病毒在不同组织中的分布呈现出明显的动态变化。在感

染初期，病毒主要在呼吸道组织中复制和分布。以易■腔和气管为例，研究表明，在感染后1-

2天，鼻腔和气管中的病毒载量迅速升高。通过RT-PCR检测发现，鼻腔组织中的病毒核酸

拷贝数在感染后第1天可达10A4-10A5copies/g,气管组织中的病毒载量也在同一时期达到

较高水平。这是因为呼吸道黏膜上皮细胞是病毒入侵的首要靶细胞，病毒通过鼻腔接种后，

能够迅速与呼吸道上皮细胞表面的受体结合并进入细胞，从而在呼吸道组织中大量复制。

随着感染时间的延长，病毒逐渐扩散到肺部组织。在感染后3-5天，肺部成为病毒载量最高

的组织。在肺组织中，病毒主要感染肺泡上皮细胞和巨噬细胞。通过免疫组化和原位杂交技

术可以观察到，病毒抗原和核酸在肺泡上皮细胞和巨噬细胞中大量存在。此时，肺部的病毒

载量可高达10人6-10人7copies/g。病毒在肺部的大量复制会引发严重的肺部炎症反应，导致

肺泡炎、肺纤维化等病理变化，进而影响肺部的正常功能，出现呼吸急促、呼吸困难等临床症

状。

除了呼吸道组织，病毒在其他器官中也有一定程度的分布。在肝脏中，感染后5-7天可检测

到病毒的存在，病毒载量相对较低，一般在10人2-10八3copies/g。这可能是由于病毒通过血

液循环到达肝脏，感染肝脏细胞。肝脏中的枯否细胞等免疫细胞也会对病毒感染做出反应，

参与免疫防御过程。在心脏组织中，感染后7-10天可检测到少量病毒，病毒载量约为10八1

A

-102copies/g0病毒感染心脏可能会影响心脏的正常功能，导致心肌细胞损伤、心律失常

等问题。在大脑组织中，虽然病毒载量相对较低，但在感染后10-14天仍可检测到病毒，这

表明病毒可能通过血脑屏障进入大脑，感染神经元和胶质细胞，从而引发神经系统症状。

4.3.3病毒载量与致病性关联

病毒载量与小鼠的致病性之间存在着密切的相关性。一般来说，高病毒载量往往与严重的病

理变化和临床症状相关。在感染SARS相关冠状病毒的小鼠中，当肺部病毒载量较高时，肺

部的病理损伤更为严重。研究发现，当肺部病毒载量达到10人6・10人7copies/g以上时，小鼠

肺部会出现广泛的肺泡炎，肺泡间隔明显增宽，炎性细胞大量浸润，肺泡腔内渗出物增多，甚

至出现透明膜形成和肺纤维化等严重病理改变。这些病理变化会导致肺部气体交换功能严重

受损，小鼠出现呼吸急促、呼吸困难等症状，体重也会明显下降，精神状态变差。

高病毒载量还可能引发过度的免疫反应，导致免疫病理损伤。当病毒在体内大量复制时，免

疫系统会被过度激活，产生大量的细胞因子和趋化因子。这些细胞因子和趋化因子会招募大

量的免疫细胞到感染部位，引发炎症反应。然而，过度的炎症反应会导致组织损伤，甚至引

发细胞因子风暴。细胞因子风暴会进一步加重病情，导致多器官功能衰竭，增加小鼠的死亡

率。

低病毒载量的小鼠，其病理变化和临床症状相对较轻。当病毒载量较低时，小鼠的免疫系统

可能能够有效地控制病毒的复制和传播，肺部的炎症反应也相对较轻，病理损伤不明显，小鼠

的临床症状也较为轻微，可能仅表现为短暂的体重下降和轻微的呼吸道症状。通过对病毒载

量与致病性的关联研究，可以更深入地了解SARS相关冠状病毒的致病机制，为开发有效的

治疗策略提供重要的依据。

4.4免疫反应研究

4.4.1先天性免疫应答

在SARS相关冠状病毒感染小鼠的过程中，先天性免疫应答迅速启动，成为抵御病毒入侵的

第一道防线。巨噬细胞作为先天性免疫细胞的重要成员，在感染早期发挥着关键作用。当病

毒侵入小鼠体内后，肺泡巨噬细胞会迅速识别病毒，并通过吞噬作用将病毒摄入细胞内。巨

噬细胞表面表达多种模式识别受体(PRRs),如Toll样受体(TLRs)等，这些受体能够识

别病毒的病原体相关分子模式(PAMPs)o以TLR3为例，它能够特异性地识别病毒的双链

RNA,激活下游的信号通路诱导巨噬细胞产生一系列的细胞因子和趋化因子。研究表明，

在感染后1-2天，小鼠肺泡巨噬细胞中的TLR3表达水平显著升高，同时伴随着白细胞介素

1P(IL-邛)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)等促炎细胞因子的大量分泌。IL-邛可以促进炎症细

胞的活化和募集，增强免疫反应；TNF-a则具有直接的抗病毒作用，同时也能诱导细胞凋

亡，清除被病毒感染的细胞。

树突状细胞(DCs)在先天性免疫应答中也扮演着重要角色。DCs能够摄取、加工和呈递病

毒抗原，激活T淋巴细胞，从而启动适应性免疫应答。在SARS相关冠状病毒感染小鼠后，

肺组织中的DCs会被迅速激活，迁移到局部淋巴结。在迁移过桂中，DCs会摄取病毒抗原，

并将其加工成抗原肽段，与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，呈递给T淋巴细胞。

研究发现，感染后3-5天，小鼠肺组织中DCs的数量明显增加，其表面的共刺激分子如

CD80、CD86等表达上调，这表明DCs的功能被激活，能够更有效地激活T淋巴细胞。

DCs还能分泌细胞因子，如白细胞介素12(IL-12)等，促进T淋巴细胞向Th1细胞分化，

增强细胞免疫反应。

自然杀伤细胞(NK细胞)是先天性免疫的重要效应细胞它能够直接杀伤被病毒感染的细

胞。在SARS相关冠状病毒感染小鼠时，NK细胞的活性会增强。NK细胞通过识别被病毒

感染细胞表面的异常分子，如应激诱导的配体等，释放穿孔素和颗粒酶，导致被感染细胞凋

亡。研究表明，在感染后3・7天，小鼠脾脏和肺组织中的NK细胞数量增加，其杀伤活性也

显著增强。NK细胞还能分泌干扰素丫(IFN-Y)等细胞因子，增强巨噬细胞和DCs的功能，

进一步促进免疫反应。

4.4.2适应性免疫应答

随着感染的持续，适应性免疫应答逐渐发挥主导作用。T淋巴细胞在适应性免疫中起着核心

作用。在SARS相关冠状病毒感染小鼠后，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞会被激

活。CD4+T淋巴细胞，也称为辅助性T细胞(Th细胞)，可以分化为不同的亚群，如

Th1、Th2、Th17等。Th1细胞主要分泌IFN-丫、TNF-B等细胞因子，这些细胞因子能够激

活巨噬细胞，增强细胞免疫反应，促进对病毒的清除。研究发现，在感染后7-10天，小鼠

体内Th1细胞的比例明显增加，IFN-y的分泌水平也显著升高。Th2细胞则主要分泌IL-4、

IL-5、IL-10等细胞因子，这些细胞因子主要参与体液免疫，促进B淋巴细胞的活化和抗体的

产生。Th17细胞分泌IL-17等细胞因子，在炎症反应和免疫防御中也发挥着重要作用。

CD8+T淋巴细胞，即细胞青性T细胞(CTL),能够特异性地杀伤被病毒感染的细胞。CTL

通过识别被感染细胞表面的MHCI类分子与病毒抗原肽的复合物，释放穿孔素和颗粒酶，导

致被感染细胞凋亡。研究表明，在感染后10-14天，小鼠体内CD8+T淋巴细胞的数量明显

增加，其杀伤活性也显著增三虽。CD8+T淋巴细胞还能分泌细胞因子，如IFN-Y等，进一步增

强免疫反应。

B淋巴细胞在适应性免疫应答中主要负责产生抗体。在SARS相关冠状病毒感染小鼠后，B

淋巴细胞会被激活，分化为浆细胞，产生特异性抗体。抗体可以通过多种方式发挥作用，如

中和病毒，阻止病毒与宿主细胞的结合；调理作用，促进巨噬细胞对病毒的吞噬；激活补体系

统，增强免疫反应等。研究发现，在感染后10-14天，小鼠血清中开始检测到特异性抗体，

抗体水平随着感染时间的延长而逐渐升高。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法可以检

测到小鼠血清中的IgM、IgG等抗体亚型。IgM是感染早期产生的抗体，其分子量较大，具

有较高的亲和力，能够快速结合病毒，发挥免疫防御作用。IgG则是感染后期的主要抗体，

其半衰期较长，能够持续发挥免疫保护作用。

4.4.3免疫反应对致病性影响

免疫反应在SARS相关冠状病毒感染小鼠的过程中，既发挥着清除病毒的关键作用，又可能

导致免疫病理损伤，这两者之间的平衡对于小鼠的病情发展和预后至关重要。在病毒清除方

面，先天性免疫应答和适应性免疫应答协同作用。先天性免疫细胞如巨噬细胞、NK细胞等在

感染早期迅速启动免疫反应，通过吞噬病毒、杀伤被感染细胞以及分泌细胞因子等方式，限制

病毒的复制和传播。适应性免疫应答中的T淋巴细胞和B淋巴细胞则在感染后期发挥重要作

用。T淋巴细胞能够直接杀伤被病毒感染的细胞，B淋巴细胞产生的抗体可以中和病毒，从

而有效地清除病毒。研究表明，在免疫功能正常的小鼠中，随着免疫反应的增强，病毒载量

逐渐下降，小鼠的病情也逐渐好转。

然而，过度的免疫反应也可能导致免疫病理损伤。在SARS相关冠状病毒感染小鼠时，可能

会引发细胞因子风暴o细胞因子风暴是指机体免疫系统过度激活，大量释放细胞因子，如IL-

6、TNF-a等。这些细胞因子会引起全身炎症反应，导致血管内皮细胞损伤、肺水肿、呼吸衰

竭等严重的病理变化。研究发现，在一些病情严重的小鼠中，体内细胞因子水平显著升高，

出现了明显的细胞因子风暴症状。细胞因子风暴会进一步加重炎症反应，导致组织损伤，甚

至引发多器官功能衰竭，增加小鼠的死亡率。免疫反应还可能导致自身免疫损伤。在免疫反

应过程中，免疫系统可能会错误地攻击自身组织和器官，导致自身免疫性疾病的发生。在

SARS相关冠状病毒感染小鼠的研究中，发现部分小鼠出现了自身抗体，这些自身抗体可能会

与自身组织结合，引发自身免疫损伤。

五、案例分析

5.1案例一：某实验室构建的hACE2转基因小鼠模型

5.1.1模型构建细节

在某实验室构建hACE2转基因小鼠模型的过程中，采用了先进的基因编辑技术。首先，研究

人员通过基因克隆技术，从人类基因组文库中获取了全长的人ACE2基因。为了确保人

ACE2基因能够在小鼠体内稳定表达，研究人员对其进行了精心的载体构建。他们选用了

pCAGGS载体，该载体包含了强启动子CAG。CAG启动子由巨细胞病毒(CMV)早期增强

子、鸡氏肌动蛋白启动子和兔珠蛋白polyA信号序列组成，具有强大的转录激活能力，能

够驱动外源基因在多种组织和细胞中广泛且高效地表达。将人ACE2基因插入到pCAGGS

载体的多克隆位点，构建成重组表达载体pCAGGS-hACE2。

在受精卵的准备阶段，选用健康的C57BL/6小鼠作为供体。通过超数排卵技术，对雌性

C57BL/6小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG),促进其

卵巢内卵泡的发育和成熟。在hCG注射后的合适时间点，对小鼠进行输卵管取卵，获取大量

的受精卵。

随后，运用显微注射技术将重组表达载体pCAGGS-hACE2导入受精卵的原核中。这一过程

需要极其精细的操作，研究人员借助高精度的显微操作仪，将含有目的基因的载体溶液缓慢地

注入受精卵的原核内。注射后的受精卵经过短暂的体外培养，筛选出状态良好的胚胎。

胚胎移植是模型构建的关键步骤之一。将筛选后的胚胎移植到同步发情的假孕母鼠的输卵管

内。假孕母鼠是通过与结扎输精管的公鼠交配而获得的，其生理状态与正常受孕母鼠相似，

但实际上并未受精。通过将转基因胚胎移植到假孕母鼠体内，为胚胎的发育提供了适宜的子

宫环境。经过一段时间的孕育，假孕母鼠分娩出子代小鼠。

对子代小鼠进行基因型鉴定是确保模型成功构建的重要环节。研究人员采用聚合酶链式反应

(PCR)技术，设计了针对人ACE2基因的特异性引物。通过提取子代小鼠的基因组DNA,

以其为模板进行PCR扩增c如果扩增出预期大小的特异性条带，则表明小鼠基因组中成功整

合了人ACE2基因。为了进一步确定人ACE2基因的表达情况，还运用了实时荧光定量PCR

(RT-qPCR)技术和蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术。RT-qPCR技术可以检测小鼠组

织中hACE2mRNA的表达水平，通过与内参基因的比较，准确地量化hACE2基因的转录情

况。Westernblot技术则用于检测hACE2蛋白的表达，通过将小鼠组织蛋白进行电泳分离、

转膜、免疫杂交等一系列操作，使用特异性的抗hACE2抗体来检测目的蛋白的表达情况。经

过严格的鉴定，筛选出了稳定表达hACE2的转基因小鼠品系。

5.1.2致病性研究结果

在对该hACE2转基因小鼠模型进行SARS相关冠状病毒感染后的致病性研究中，观察到了一

系列显著的结果。在临床症状方面，感染后的小鼠体重迅速下降。在感染后的第3天，小鼠

体重平均下降约10%,到第5天，体重下降幅度可达15%-20%。小鼠精神萎靡，活动明

显减少，大部分时间蜷缩在饲养笼的角落，对周围环境的刺激反应迟钝。呼吸急促症状也较

为明显，呼吸频率从正常的每分钟160-210次增加到每分钟250-300次，部分小鼠甚至出

现呼吸困难，表现为呼吸时腹部起伏剧烈，鼻翼煽动。

病理变化方面，肺部呈现出典型的间质性肺炎特征。肺泡间隔明显增宽，这是由于炎性细胞

浸润和间质水肿所致。炎性细胞主要包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。巨噬细胞在感

染早期被激活，它们吞噬病毒并释放细胞因子，引发炎症反应。淋巴细胞参与适应性免疫反

应，在感染过程中，其功能可能受到抑制，导致免疫失衡。中性粒细胞的浸润会释放大量的

炎症介质，进一步加重炎症。肺泡腔内可见渗出物，包括浆液、纤维蛋白和炎性细胞等，这

些渗出物会影响肺泡的气体交换功能。在严重的病例中，肺泡腔内还出现了透明膜形成，透

明膜主要由纤维蛋白、坏死细胞碎片和炎性渗出物组成，它的形成会进一步阻碍气体交换，是

导致呼吸衰竭的重要原因之一。

在其他器官方面，肝脏出现肝细胞变性，表现为肝细胞肿胀、胞质疏松，部分肝细胞出现坏

死，肝小叶结构遭到破坏，汇管区可见炎性细胞浸润。心脏出现心肌细胞变性，心肌间质水

肿和炎性细胞浸润，这可能会影响心脏的正常功能，导致心肌收缩力下降，心输出量戒少。

病毒载量检测结果显示，在感染后的第1-2天，鼻腔和气管中的病毒载量迅速升高，通过实

时荧光定量PCR检测，鼻腔组织中的病毒核酸拷贝数在感染后第1天可达10M-10^5

copies/g,气管组织中的病毒载量也在同一时期达到较高水平。随着感染时间的延长，肺部

成为病毒载量最高的组织，在感染后3-5天，肺部病毒载量可高达10A6-10A7copies/g。

在肝脏、心脏等其他器官中也检测到了一定量的病毒，但病毒载量相对较低。

免疫反应研究表明，在感染早期，先天性免疫应答迅速启动。巨噬细胞表面的Toll样受体

(TLRs)识别病毒的病原体相关分子模式(PAMPs),激活下游信号通路，诱导巨噬细胞产

生白细胞介素1B(IL-10)、肿瘤坏死因子。(TNF-a)等促炎细胞因子。随着感染的持续，

适应性免疫应答逐渐发挥主导作用。T淋巴细胞和B淋巴细胞被激活，T淋巴细胞分化为不

同的亚群，如Th1、Th2、Th17等，它们分泌不同的细胞因子，参与免疫调节和病毒清除。

B淋巴细胞分化为浆细胞，产生特异性抗体，如IgM和七G。IgM在感染早期产生，能够快

速结合病毒，发挥免疫防御作用；IgG则在感染后期大量产生，持续发挥免疫保护作用。

5.1.3经验与启示

从该案例中可以总结出多方面的宝贵经验和启示。在模型构建方面，选择合适的基因编辑技

术和载体至关重要。采用pCAGGS载体结合显微注射技术，成功实现了人ACE2基因在小

鼠体内的稳定表达。这提示在构建其他基因编辑小鼠模型时，要充分考虑载体的特性，如启

动子的强度、组织特异性等，以及基因编辑技术的准确性和效率。在受精卵的获取和处理过

程中，超数排卵技术和体外培养条件的优化，为获得高质量的受精卵和胚胎提供了保障。这

表明在动物模型构建过程中，要注重实验操作的细节，优化实验条件，以提高模型构建的成功

率。

在致病性研究方面，系统、全面的检测方法是获得准确结果的关键。通过对小鼠临床症状的

密切观察、病理变化的详细分析、病毒载量的精确检测以及免疫反应的深入研究，全面揭示了

SARS相关冠状病毒在hACE2转基因小鼠体内的致病性。这启示其他研究在开展致病性研究

时，要综合运用多种检测手段，从不同角度对研究对象进行分析，以获得更全面、准确的研究

结果。该案例中对不同时间点、不同组织器官的检测，为研究病毒感染的动态过程提供了范

例。在研究病毒感染的过程中，要关注病毒在不同组织器官中的分布和复制情况，以及免疫

反应在不同阶段的变化，从而深入了解病毒的致病机制。

5.2案例二：病毒适应进化获得的小鼠模型

5.2.1适应进化过程

在某研究中，研究人员为了获得适应小鼠的SARS相关冠状病毒株，采用了连续传代的方

法。首先，选取具有代表性的SARS相关冠状病毒临床株，将其通过鼻腔接种的方式感染

BALB/c小鼠。感染剂量经过精确计算，以确保每只小鼠接种的病毒量一致，初始接种剂量为

1(T5PFU/只。接种后，密切观察小鼠的临床症状。在感染后的第3・5天，小鼠开始出现

体重下降、精神萎靡等症状。此时，采集小鼠的肺组织样本。

肺组织样本经过匀浆处理，加入适量的病毒保存液，充分研磨后，离心取上清液，获得含有病

毒的悬液。将该悬液进行病毒的分离和培养，通过在Ver。细胞上进行病毒的扩增，获得子代

病毒。将子代病毒再次感染新的BALB/c小鼠，重复上述过程。在连续传代过程中，对每一

代病毒的生物学特性进行详细分析。研究人员发现，随着传代次数的增加，病毒在小鼠体内

的复制能力逐渐增强。通过实时荧光定量PCR