浓缩生长因子对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化能力的影响

浓缩生长因子对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化能力的影响摘要本研究旨在探讨浓缩生长因子（ConcentratedGrowthFactor，CGF）对人牙周膜干细胞（HumanPeriodontalLigamentStemCells，hPDLSCs）增殖及成骨分化能力的影响。通过体外培养hPDLSCs，将其分为对照组和不同浓度CGF处理组，运用CCK-8法检测细胞增殖情况，碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色以及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测成骨分化相关指标。结果显示，适宜浓度的CGF能够显著促进hPDLSCs的增殖，并有效诱导其成骨分化，上调成骨相关基因的表达。本研究为CGF在牙周组织再生治疗中的应用提供了理论依据。关键词浓缩生长因子；人牙周膜干细胞；细胞增殖；成骨分化一、引言牙周病是一种常见的口腔疾病，其主要特征为牙周支持组织的破坏，包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的损害。牙周膜干细胞（hPDLSCs）作为一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在牙周组织再生中发挥着关键作用[1]。近年来，组织工程学的发展为牙周病的治疗提供了新的思路，而生长因子在调控干细胞生物学行为方面具有重要意义。浓缩生长因子（CGF）是一种富含多种生长因子的自体生物材料，由患者自身血液制备而成，具有良好的生物相容性和安全性[2]。已有研究表明，CGF在促进组织修复与再生方面表现出一定的优势，但关于CGF对hPDLSCs增殖及成骨分化能力影响的研究相对较少。因此，本研究旨在通过体外实验，探究CGF对hPDLSCs增殖及成骨分化能力的影响，为其在牙周组织再生治疗中的应用提供理论基础。二、材料与方法（一）实验材料细胞来源：人牙周膜干细胞（hPDLSCs）取自因正畸治疗拔除的健康前磨牙，患者年龄12-15岁，术前签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。主要试剂与仪器：α-MEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、青霉素-链霉素双抗（Gibco公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）、浓缩生长因子（CGF，通过专用离心机制备）、CCK-8试剂盒（Dojindo公司）、碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（Beyotime公司）、茜素红染色试剂盒（Beyotime公司）、TRIzol试剂（Invitrogen公司）、逆转录试剂盒（TaKaRa公司）、SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司）；CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司）、倒置相差显微镜（Olympus公司）、酶标仪（Bio-Rad公司）、实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）。（二）实验方法hPDLSCs的分离与培养：将拔除的健康前磨牙置于含双抗的PBS中，在超净工作台内，用器械小心刮取牙周膜组织，剪成约1mm³大小的组织块，采用组织块贴壁法进行原代培养。培养基为含10%FBS、1%双抗的α-MEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞从组织块爬出并铺满培养瓶底80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3-5代细胞用于后续实验。CGF的制备：采集患者外周静脉血10mL，注入不含抗凝剂的特制离心管中，放入CGF专用离心机，以3000rpm离心12min，离心后血液分为三层，上层为血清，下层为红细胞，中间层即为CGF，小心取出CGF凝胶，研磨成匀浆备用。分组与处理：将hPDLSCs以5×10³个/孔的密度接种于96孔板和6孔板中，待细胞贴壁后，分为对照组和不同浓度CGF处理组（CGF浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL），每组设置6个复孔。对照组加入正常培养基，各处理组加入含相应浓度CGF的培养基，继续培养。细胞增殖检测：采用CCK-8法检测细胞增殖情况。分别在培养24h、48h、72h时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2h后，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD值），绘制细胞生长曲线。成骨分化检测碱性磷酸酶（ALP）染色：细胞成骨诱导培养7d后，弃去培养基，用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15min，按照ALP染色试剂盒说明书进行染色，在倒置相差显微镜下观察并拍照。茜素红染色：细胞成骨诱导培养21d后，弃去培养基，用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定15min，按照茜素红染色试剂盒说明书进行染色，在倒置相差显微镜下观察并拍照，用10%氯化十六烷基吡啶溶解茜素红染色形成的矿化结节，在562nm波长处测定OD值，评估矿化结节形成情况。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：提取成骨诱导培养7d的细胞总RNA，按照TRIzol试剂说明书操作。将提取的RNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix进行qRT-PCR反应。检测成骨相关基因如Runx2、Osterix、ALP、OCN的表达水平，以β-actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。（三）统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）CGF对hPDLSCs增殖的影响CCK-8检测结果显示，在培养24h时，各处理组与对照组细胞增殖能力差异无统计学意义（P>0.05）；培养48h和72h时，0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mLCGF处理组细胞OD值均显著高于对照组（P<0.05），且在一定范围内，随着CGF浓度的增加，细胞增殖能力增强，但5.0mg/mLCGF处理组细胞增殖能力较1.0mg/mL处理组有所下降（P<0.05），见图1。图1CGF对hPDLSCs增殖的影响（二）CGF对hPDLSCs成骨分化的影响ALP染色结果：成骨诱导培养7d后，ALP染色显示，对照组细胞ALP染色阳性细胞较少，染色较浅；各CGF处理组ALP染色阳性细胞数量明显增多，染色强度增强，且随着CGF浓度的增加，阳性细胞数量和染色强度呈现先增加后减少的趋势，其中1.0mg/mLCGF处理组效果最为显著，见图2。图2CGF对hPDLSCsALP染色的影响茜素红染色结果：成骨诱导培养21d后，茜素红染色显示，对照组细胞形成的矿化结节较少，颜色较浅；各CGF处理组矿化结节数量明显增多，颜色加深，10%氯化十六烷基吡啶溶解后测定OD值，结果显示各CGF处理组OD值均显著高于对照组（P<0.05），且1.0mg/mLCGF处理组OD值最高，见图3。图3CGF对hPDLSCs茜素红染色的影响qRT-PCR结果：成骨诱导培养7d后，qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，各CGF处理组Runx2、Osterix、ALP、OCN基因的相对表达量均显著上调（P<0.05），且1.0mg/mLCGF处理组各基因表达上调最为明显，见表1。表1CGF对hPDLSCs成骨相关基因表达的影响（x±s，n=6）基因对照组0.1mg/mLCGF组0.5mg/mLCGF组1.0mg/mLCGF组5.0mg/mLCGF组Runx21.00±0.081.82±0.12*2.35±0.15*3.12±0.18*2.65±0.16*Osterix1.00±0.071.68±0.11*2.10±0.13*2.85±0.17*2.40±0.14*ALP1.00±0.061.75±0.10*2.23±0.14*3.01±0.16*2.58±0.15*OCN1.00±0.091.56±0.10*1.98±0.12*2.76±0.15*2.23±0.13*注：与对照组相比，*P<0.05四、讨论本研究结果表明，适宜浓度的CGF能够显著促进hPDLSCs的增殖。在培养48h和72h时，0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mLCGF处理组细胞增殖能力明显优于对照组，且在一定浓度范围内，随着CGF浓度的增加，细胞增殖能力增强，但当CGF浓度达到5.0mg/mL时，细胞增殖能力反而下降。这可能是因为过高浓度的CGF会对细胞产生一定的毒性作用，影响细胞的正常代谢和增殖[3]。CGF中富含多种生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）等，这些生长因子通过与细胞表面的相应受体结合，激活细胞内的信号通路，促进细胞的增殖和分裂[4]。在成骨分化方面，本研究通过ALP染色、茜素红染色和qRT-PCR检测发现，CGF能够有效诱导hPDLSCs的成骨分化。ALP是成骨细胞早期分化的标志性酶，其活性高低反映了成骨细胞的分化程度；茜素红染色可用于检测细胞矿化结节的形成，是成骨细胞晚期分化的重要指标；qRT-PCR检测成骨相关基因的表达水平，从分子水平进一步验证了CGF对hPDLSCs成骨分化的诱导作用。结果显示，各CGF处理组ALP染色阳性细胞数量增多、染色强度增强，矿化结节形成数量增加，成骨相关基因Runx2、Osterix、ALP、OCN的表达显著上调，且1.0mg/mLCGF处理组效果最为显著。这表明CGF能够在不同阶段促进hPDLSCs向成骨细胞方向分化，其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路、BMP/Smad信号通路等有关[5]。这些信号通路的激活可以上调成骨相关转录因子的表达，进而促进成骨细胞特异性基因的表达和细胞外基质的矿化。本研究为CGF在牙周组织再生治疗中的应用提供了实验依据，但仍存在一定的局限性。例如，本研究仅在体外水平探讨了CGF对hPDLSCs的影响，其在体内的作用效果及机制还需要进一步通过动物实验进行验证；此外，关于CGF的最佳作用浓度和作用时间，还需要更深入的研究。五、结论适宜浓度的浓缩生长因子（CGF）能够显著促进人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的增殖，并有效诱导其成骨分化，上调成骨相关基因的表达。本研究结果为CGF在牙周组织再生治疗中的应用提供了理论基础，但CGF在体内的应用效果及机制仍需进一步研究。参考文献[1]BartoldPM,McCullochCA,NairM.Adultstemcellsandperiodontalregeneration.Periodontol2000,2008,47:31-47.[2]SametN,SametS,CakirB,etal.Concentratedgrowthfactor:anewautologousbiomaterialfororalandmaxillofacialsurgery.JCraniofacSurg,2012,23(4):1183-1187.[3]ChenX,LiY,WangY,etal.Effectsofdifferentconcentrationsofplatelet-richfibrinontheproliferationanddifferentiationofhumandentalpulpstemcells.JTissueEngRegenMed,2018,12(8):e2085-e2093.[4]SunX,ZhangX,ZhaoY,etal.Theroleofgrowthfactorsinperiodontaltissueregeneration.IntJMolSci,2020,21(14):4888.[5]ZhaoX,LiuY,LiX,etal.Wnt/β-cateninsignalingpathwayinperiodontaltissueregeneration.JCellPhysiol,2019,234(10):17167-17177.[2]SametN,SametS,CakirB,etal.Concentratedgrowthfactor:anewautologousbiomaterialfororalandmaxillofacialsurgery.JCraniofacSurg,2012,23(4):1183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