3.2.3基因工程的基本操作程序+第三、四步课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞基因表达载体导入动物植物微生物将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法植物细胞1、花粉管通道法方法一：子房注射法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液（我国科学家独创）1将目的基因导入植物细胞2.适用生物：1.受体细胞：受精卵1、花粉管通道法1将目的基因导入植物细胞方法二：

柱头处理法在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。3.特点：简便经济，但要求花朵较大开花植物2、农杆菌转化法1将目的基因导入植物细胞

农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。问题1：农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？（p81）

农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。当双子叶植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。冠瘿瘤（1）

农杆菌：2、农杆菌转化法1将目的基因导入植物细胞问题2：为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞（2）

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质：基因重组（控制不同性状的基因的重新组合）2、农杆菌转化法（3）

过程：目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达思考：农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养需要农杆菌产生的vir蛋白切割T-DNA两次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。第二次拼接：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。2、农杆菌转化法（3）

过程：两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。第二次导入：含含目的基因的T-DNA导入受体细胞。农杆菌转化法共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？

2、农杆菌转化法（4）

具体转化方法：随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。方法一：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。方法二：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。思考：1、方法1筛选出的转化细胞怎样再生成植株？2、以上两种方法的受体细胞有何不同？受体细胞为体细胞植物组织培养：利用植物细胞的全能性受体细胞为受精卵2将目的基因导入动物细胞1、导入方法：2、受体细胞:显微注射法受精卵为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①体积大，易操作。3、过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物②易表现出全能性。（1）常用方法：Ca2+处理常用原核细胞（大肠杆菌应用最广泛）目的：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）（2）受体细胞：Ca2+感受态细胞吸收大肠杆菌Ca2+表达载体

Ca2+处理法示意图2将目的基因导入微生物细胞繁殖快单细胞遗传物质少易培养实例：利用转基因大肠杆菌生产药物转录翻译如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？剪切、连接加工真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA成熟mRNA多肽链蛋白质（四级结构）原因：①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA；②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）一般不能产生原来的蛋白质胰腺提取筛选胰岛素mRNA胰岛素

cDNA逆转录重组质粒质粒导入大肠杆菌mRNA胰岛素原胰岛素加工原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。实例：利用转基因大肠杆菌生产药物如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？转两个T基因普通棉花细胞有三种情况，如下图所示。2.若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？甲自交→全为抗虫乙自交→抗虫：不抗虫=3:1丙自交→抗虫：不抗虫=15:1甲乙丙思考

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讨论目的基因导入受体细胞方法比较细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程花粉管通道法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵通常选原核细胞将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓早期胚胎培养、胚胎移植↓获得具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子第四步：目的基因的检测与鉴定问题1：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断是否导入成功？

若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。

此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达。问题2：标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？可以利用标记基因（如抗生素抗性基因）筛选成功导入基因表达载体的受体细胞，如可用含青霉素的选择培养基鉴别。思考

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讨论mRNABt抗虫蛋白抗虫棉①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质④检测是否具有抗性以及抗性程度等检测水平：分子水平个体水平Bt基因结合Bt基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测与鉴定？检测内容：分子水平分子水平分子水平检测方法一：DNA分子杂交技术1检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上问题1：DNA分子十分微小，我们该如何观察受体细胞是否含目的基因呢？问题2：放射性同位素或荧光蛋白应该标记哪种物质？

如何让目的基因也带有放射性同位素或荧光蛋白标记？（已知目的基因序列）利用放射性同位素或荧光蛋白。利用碱基互补配对原则使被标记的DNA片段与目的基因结合。标记DNA分子探针目的基因带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带，说明

了。方法一：DNA分子杂交技术问题1：探针的本质是什么？与目的基因的关系是什么？探针是一段DNA片段（通常结合放射性同位素或荧光蛋白等），探针的序列应与目的基因高度互补，避免与其他基因发生非特异性结合变性碱基互补配对原则1检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上目的基因整合到受体生物染色体DNA上211检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上方法二：PCR扩增转基因生物提取DNA根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳（常用）DNA测序技术；DNA分子杂交技术等M：marker；1：阳性质粒2：原始品系3-9：转Bt品系转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果问题1：对受体细胞的DNA进行PCR操作，引物该如何设计？结果如何检测？判断标准：5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’目的基因在整个DNA片段的中央位置电泳：在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。正极负极电场力25正极负极电场力【原理】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。电泳常用缓冲液pH8.0～8.3，DNA分子在此pH条件下带____电荷正极负极电场力若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？负电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62~65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。2829电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62~65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。30电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。加样孔（加入待测DNA样本）31电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。片段短，迁移速率快片段长，迁移速率慢在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关①凝胶的浓度越大，迁移速率越慢②DNA分子越大，迁移速率越慢③DNA分子构像有环状、链状等【思考】1.DNA片段位置怎么显示出来？2.怎么知道这些DNA片段大小？322检测目的基因是否转录（mRNA）转基因生物PCR操作电泳检测是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板方法二：分子杂交技术方法一：PCR扩增基因探针转基因生物的mRNA杂交分子（可检测）变性碱基互补配对原则注射小鼠体内苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）2检测目的基因是否翻译（蛋白质）方法：

抗原—抗体杂交抗原与抗体的特异性结合原理：思考：如何检测目的基因是否翻译产生了Bt抗虫蛋白？（提示：免疫学方法）个体水平的检测（1）通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物

以及

等例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。是否具有抗性抗性的程度如何检测导入的Bt基因是否具有抗虫特性？转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物（如胰岛素）饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较功能、活性正常个体水平的检测1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增人工合成DNA文库2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因等3.将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、

感受态细胞（如加Ca2+）转化法(微生物);4.目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。总结

基因工程的基本操作程序1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？转两个T基因普通棉花细胞有三种情况，如下图所示。2.若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？甲自交→全为抗虫乙自交→抗虫：不抗虫=3:1