DB34-T 3987-2021 禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程

ICS11.220CCSB4134DB34/T3987—2021禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程Technicalregulationsforcellculture,isolationanddetectionofavianleukemiavirus2021-09-03发布2021-10-03实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3987—2021I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、桐城市畜牧兽医管理中心、合肥市动物疫病预防与控制中心、肥西县农业综合行政执法大队、滁州市动物疫病预防与控制中心、望江县畜牧兽医技术推广中心、宣城市动物防疫站、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省新联禽业股份有限公司、阜南县农业农村局、池州市动物疫病预防与控制中心。本文件主要起草人：沈学怀、王华付、司宏富、董先敏、季晶晶、胡江苗、程帮照、潘孝成、戴银、张丹俊、尹磊、赵瑞宏、胡晓苗、钱昌银、刘华、陈辉、翟银建、江美莲。DB34/T3987—20211禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程本文件规定了禽白血病病毒细胞培养分离检测的血浆、精液、蛋清和肛拭子样品处理与接种、细胞样品的检测等技术内容和要求。本文件适用于禽白血病净化中血浆、精液、蛋清和肛拭子样品中禽白血病病毒的细胞培养分离检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T26436禽白血病诊断技术GB/T36873原种鸡群禽白血病净化检测规程NY/T680禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽白血病病毒avianleukosisvirus，ALVALV属于反转录病毒科的ɑ反转录病毒属。ALV可分为A～J10个亚群，其中A、B、C、D、E和J亚群病毒与鸡的禽白血病相关，可诱发鸡不同组织的良性和恶性肿瘤。A、B、C、D和J亚群属外源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒为内源性病毒，其致病性很低或没有致病性。3.2鸡胚成纤维细胞系DF-1chickenembryofibroblastcelllineDF-1为鸡胚成纤维细胞的自发永生化细胞系。4接种样品的准备4.1血液样品的准备4.1.1血液的采集用消毒酒精棉球对鸡翅下静脉部位进行消毒，使用1mL一次性注射器或真空采血管进行采血，使用1mg/mL肝素钠作为抗凝剂。使用1mL注射器时先吸入0.1mL肝素钠，采血至1mL，或使用含肝素钠抗凝剂的真空采血管采血1～2mL。DB34/T3987—202124.1.2血浆的分离与保存采集的鸡抗凝血样品应保存在4℃环境下，采集的鸡血液样品应尽快处理并接种DF-1细胞，保存期限最长不超过6h，否则应重新采样。将鸡抗凝血样品转移至灭菌离心管中，2000r/min离心2min，4.2公鸡精液样品的准备4.2.1公鸡精液的采集应按照GB/T36873中规定的方法进行种公鸡精液的采集。4.2.2公鸡精液样品的保存与处理采集的公鸡精液样品应保存在4℃环境下，保存期限不超过6h。在无菌的1.5mL的离心管中，加入精液样品40μL，加入精液稀释液160μL，振荡混匀，在4℃条件下10000r/min离心5min，备用。4.3鸡蛋清样品的准备4.3.1鸡蛋清样品的采集清洗和消毒鸡蛋表面，在无菌操作台中，用鸡蛋开孔器在鸡蛋的气室端开口，无菌100μL蛋清样品转移至灭菌离心管中暂存，使用鸡蛋开孔器时应避免样品间交叉污染。4.3.2鸡蛋清样品的保存与处理采集的蛋清样品应保存在4℃环境下，保存期限不超过6h。在100uL蛋清样品离心管中加入100μL灭菌PBS，充分混合后，备用。4.4肛拭子样品的准备肛拭子样品的采集和处理应按照GB/T26436中的方法执行，肛拭子样品应保存在4℃环境下，保存期限不超过6h。5接种细胞的准备取生长状态良好的DF-1细胞，常规传代消化，调整细胞密度为1×105个细胞/mL，接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1mL。待细胞生长至占细胞贴壁面70％时，弃去孔中的培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞面三次后，可用于样品的接种。6样品接种6.1鸡血浆样品的接种将4.1.2中处理后的血液样品用移液器吸头轻轻旋转上层血浆，使处于中层的白细胞悬浮于血浆中，吸取100μL血浆接种到DF-1细胞培养孔中，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记，并在每个细胞培养孔中加入40μL肝素钠溶液，防止血浆凝固。DB34/T3987—202136.2公鸡精液样品的接种将4.2.2中处理后的精液样品按照GB/T36873中的方法进行种公鸡精液样品的接种，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。6.3鸡蛋清样品的接种将4.3.2中处理后的蛋清样品，每个样品取100μL接种到DF-1细胞培养孔中，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。6.4肛拭子样品的接种应按照GB/T26436中的方法执行，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。7细胞的维持培养将接种样品后的细胞板放入细胞培养箱继续孵育3h后，弃去细胞培养孔中液体，用200μL灭菌PBS润洗细胞孔1次，加入细胞维持培养液1mL，继续培养7～9天，在细胞状态允许的条件下应尽可能延长细胞维持培养的时间，以利于ALV在细胞上的增殖。在24孔培养板靠边的样品孔中多加入0.3mL细胞维持培养液，以补偿样品孔的水分蒸发。8病毒的检测8.1酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测ALVp27抗原应按照NY/T680中规定的方法执行或采用符合NY/T680要求的商品化试剂盒进行检测，并按照试剂盒说明书执行。8.2间接免疫荧光抗体反应（IFA）方法检测ALV抗原应按照GB/T26436中规定的方法执行。8.3聚合酶链式反应（PCR）方法检测ALV核酸应按照GB/T26436中规定的的方法执行。DB34/T3987—20214试剂的配制A.1细胞完全培养液(pH7.2)DMED高糖培养液（商品化）450mL胎牛血清50mL青霉素链霉素01mg/mLA.2细胞维持液DMED高糖培养液（商品化）495mL胎牛血清青霉素200U/mL链霉素02mg/mLA.3磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）氯化钠氯化钾磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠蒸馏水在温度121°、压力0.12Mpa条件下灭菌15分钟。A.4D-Hank’s缓冲液氯化钠氯化钾磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠葡萄糖蒸馏水0.9g0.152g分装于200ml小瓶中，在温度121°、压力0.12Mpa条件下灭菌15分钟，临用前用无菌的5.6%NaHCO3调pH至7.2～7.6。A.50.25％胰酶消化液D-Hank’s缓冲液胰酶（粉末）DB34/T3987—202150.5mol/LEDTA1ML用1mol/LNaOH调节pH至7