DB35∕T 1929-2020 鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒检测技术规范

DB35 2规范性引用文件 7试剂盒的组成、组装和保存 8试剂盒的要求 9样品的采集、保存与运输 10试剂盒操作步骤 附录A（规范性附录）相关试剂的配制 参考文献 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业农村厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈珍、傅光华、刘道泉、刘荣昌、黄瑜、史惠、吴波平、陈翠腾、陈冬群、陈秀明、施少华、朱春华、刘斌琼、蔡国漳。鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒检测技术规范本标准规定了鸭瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的检测技术规范。本标准适用于鸭血清中鸭瘟抗体的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3疫病简述鸭瘟（duckplague，DP）又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”，是由鸭瘟病毒引起的一种急性、高度致死性传染病，不同日龄的鸭均易感染。特征病变为食道、小肠和泄殖腔粘膜出血、坏死、溃疡，病程稍长者食道和泄殖腔粘膜表面形成黄白色伪膜。该病传播迅速、发病率和死亡率高，广泛流行于我国华南、华中和华东地区。本标准是针对鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒建立的检测技术规范。工作原理为：当鸭血清中鸭瘟抗体阳性时，在间接ELISA抗体反应过程中，鸭血清中的鸭瘟抗体先与包被的纯化鸭瘟病毒结合，形成抗原抗体复合物，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸭IgG相结合，加入显色剂显色，置450nm波长下测定光密度值（OD450通过分析其P/N值判定鸭血清中鸭瘟病毒抗体的水平。所使用的主要仪器如下：a)酶标仪（具有450nm波长滤光片）。d)振荡器。e)可调微量移液器：包括多道（10µL、100µL、300µL）和单道等。所使用的主要试剂如下：a)包被抗原：按照附录A中A.1配制。b)标准阳性血清：按照附录A中A.2配制。c)标准阴性血清：按照附录A中A.3配制。d)参考品：阳性参考品（通过中和试验和本试剂盒检测均为阳性）20份，阴性参考品（通过中和试验和本试剂盒检测均为阴性）20份，每份参考品分装为每支15µL装于无菌离心管中，做好标记，置于-70℃±5℃保存备用。f)TMB显色液：TMB含量为200µg/mL。g)碳酸盐缓冲液：按照附录A中的A.4配制。h)20×PBS溶液：按照附录A中的A.5配制。k)终止液：按照附录A中的A.8配制。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682—2008中一级水的要7试剂盒的组成、组装和保存7.1.1标准阴性血清，10µL，清亮、无溶血。7.1.2标准阳性血清，10µL，清亮、无溶血。7.1.3酶标二抗，10µL，无色透明液体。7.2.1包被好的酶标板，3块，每个酶标板最大检测待检样品份数为90份。7.2.2磷酸盐缓冲液（20×PBS），100mL，无色透明。7.2.3TMB显色液，10mL/瓶×3瓶，无色透明，棕色瓶装，避光保存。7.2.4终止液，40mL，无色透明。7.2.5吐温-20，500µL，无色透明。7.3试剂盒的组装7.3.1本试剂盒由试剂盒A和试剂盒B组成。7.3.2试剂盒外包装上应标明产品名称、包装规格、生产单位、生产批号、生产日期、有效期、产品标准编号、注册编号和保存条件。7.3.3各组分均应贴上标签（内容包括：组分名称、生产日期、数量、保存条件）。7.4试剂盒的保存试剂盒A于-20℃±1℃条件下保存，试剂盒B于2℃~8℃条件下保存。8试剂盒的要求8.1物理检查8.1.1外观：各组分外包装应完好、品名清晰。8.1.2试剂盒：各组分应齐全、完整，液体无渗漏、澄清透明无沉淀。8.2阳性参考品的符合率按试剂盒操作说明书对阳性参考品进行检测，检测结果与阳性参考品的符合率不低于95%。8.3阴性参考品的符合率按试剂盒操作说明书对阴性参考品进行检测，检测结果与阴性参考品的符合率不低于95%。8.4最低检测限按试剂盒操作说明书对不同稀释度的标准阳性血清进行ELISA检测时，最低检测限为1:3200。8.5批内差按试剂盒操作说明书对阴阳性参考品进行检测，取10个不同试剂盒平行检测，计算检测结果的平均值M和标准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，CV不宜高于10%。CV——变异系数；SD——测量结果的标准差；M——测量结果的平均值。8.6批间差取3个批次的试剂盒（每批次10个对阴阳性参考品进行检定，计算30次检测结果的平均值M和标准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，结果不宜高于10%。8.7有效期试剂盒的有效保存期为12个月。8.8稳定性8.8.1效期稳定性：取贮存条件下保存13个月的试剂盒，按8.2～8.5方法进行检测，结果应符合8.4DB35/T1929—20209样品的采集、保存与运输9.1样品采集采集鸭翅静脉血0.5mL～1.0mL，37℃±1℃恒温箱静置1h后转入2℃~8℃条件下静置2h~4h，析出液体即为待检血清。9.2样品保存置于-20℃±1℃条件下贮存备用，使用前2h取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需当天使用，则放置2℃~8℃条件下备用。9.3样品运输血清样品应在-20℃±1℃条件下运输。10试剂盒操作步骤10.1试剂均衡用前TMB显色液、终止液和磷酸盐缓冲液应取出室温均衡30min。10.2试剂配制从试剂盒B中取出20×PBS溶液、吐温-20，按照附录A中A.6和A.7配制1×PBS工作液和PBST工作液。从试剂盒B中取出酶标板，试剂盒A中取出标准阴性血清和标准阳性血清。待检血清标准阴性血清和标准阳性血清用1×PBS按1:100倍稀释后加入酶标板中，每孔加入100µL，其中标准阴性血清、标准阳性血清作两个重复孔，另设两个空白对照孔（每孔加入PBS100µL）。37℃±l℃恒温箱反应lh。取出酶标板，每孔加入250µLPBST洗涤液置于振荡器上振荡洗涤3次，每次3min。甩干液体。10.5加酶标二抗从试剂盒B中取出酶标二抗，用PBS作1:3333倍稀释后（取10mLPBS溶液加入3µL酶标二抗），酶标板的每孔加入100µL，于37℃±1℃恒温箱反应45min，取出后洗涤，洗涤方法同10.4。洗涤后，每孔加入TMB显色液100µL，37℃±1℃恒温箱避光显色8min～l0min后取出。10.7终止反应每孔加终止液100µL终止反应，立即读数。将酶标板置酶标仪中，以450nm波长测量反应孔OD450值。读出酶标板中各孔的OD450值之后，进行如下判定：a)以酶标仪在450nm波长下测量样品孔OD值（OD450当阴性血清的OD450值不超过0.22、阳性血清的OD450值不低于1.0、空白孔OD450值不超过0.08时试验成立。b)按照式（2）计算待检血清的t值：t=.......................................(2)N——标准阴性血清OD450平均值。c)待检血清t≥2.1判为阳性，t＜1.9判为阴性；1.9≤t＜2.1判为可疑，重检后t≥1.9可判为相关试剂的配制A.1抗原的制备取DEF细胞培养的鸭瘟病毒液于4℃、8000r/min离心30min，上清于4℃、45000r/mi弃上清后沉淀用2mL灭菌PBS重悬，获病毒浓缩液，-70℃±5℃下保存。抗原的纯化是通过蔗糖梯度离心及超速离心加以浓缩获得，方法如下：制备10%、20%、30%、40%和50%等五个梯度的蔗糖平衡液，在10%离心2h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬。测定其蛋白浓度，储于-70℃±5℃条件下作为抗原备用。A.2标准阳性血清的制备将鸭瘟病毒浓缩液经甲醛灭活后，经检验灭活合格后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂按1:1.2乳化成免疫用的抗原。按制备高免血清的常规方法免疫30日龄SPF麻鸭，首免鸭瘟病毒浓缩抗原乳化液1mL/只。14d二免，2mL/只（分三点注射），二免后28天采血、分离血清，血清中和效价≥1:128，即作为鸭瘟病毒标准阳性血清。A.3标准阴性血清的制备购进SPF麻鸭胚，孵化至鸭苗出壳后于隔离器中饲养，至30日龄时采血、分离血清，无血清中和作用（中和效价＜1:2）作为鸭瘟病毒标准阴性血清。A.4碳酸盐缓冲液0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）NaHCO31.46gNa2CO30.97g（或Na2CO3·12H2O1.2g）去离子水或蒸馏水500mLA.520×PBS溶液（pH7.4）KCl4.0gNa2HPO4·12H2O58.0gKH2PO44.0g将上述试剂溶于800mL去离子水中，定容至1000mL1.034×105）Pa高压灭菌30min，室温保存备用。A.61×PBS溶液（pH7.4）20×PBS溶液25mL蒸馏水475mL搅拌混匀，室温保存备用。A.7洗涤液吐温-200.25mL将吐温-20加入PBS溶液中充分摇匀，现配现用。A.8终止液浓硫酸11.1mL取蒸馏水388.9mL，向