中国结核分枝杆菌检验指南（2026版）

中国结核分枝杆菌检验指南（2026版）1总则本指南旨在为全国各级疾病预防控制机构、结核病定点医疗机构以及基层医疗卫生机构的结核病检验实验室提供标准化、规范化的操作依据。随着分子生物学技术的飞速发展及结核病防治策略的精准化转型，2026版指南在强调传统细菌学检验“金标准”地位的同时，大幅强化了分子诊断在早期发现、耐药筛查及菌株鉴定中的应用权重。本指南的核心目标是提高结核分枝杆菌复合群（MTBC）的检出率，缩短诊断时间，并确保药敏结果的准确性，从而为临床制定个体化治疗方案及公共卫生防控提供坚实的实验室数据支撑。实验室开展所有检测活动必须严格遵守国家相关法律法规，建立覆盖检测全过程的生物安全管理体系与质量控制体系。所有检测方法应经过性能验证，确保在投入使用时具备良好的灵敏度与特异性。对于新型检测技术，实验室需评估其适用性，并结合自身资源配置合理选择检测策略。2标本采集、运输与保存2.1标本采集规范标本采集是检验流程的第一步，其质量直接决定了后续检测的成败。临床医师应根据患者的感染部位与临床表现，选择正确的标本类型。（1）呼吸道标本：肺结核及疑似肺结核患者首选痰液。采集时应遵循“深咳”原则，确保标本来自下呼吸道。推荐采集“即时痰、夜间痰、晨间痰”三份痰标本，其中晨间痰阳性率最高。对于无痰或咳痰困难的患者，可采用高渗盐水雾化导痰，或通过支气管镜获取支气管肺泡灌洗液（BALF）、支气管刷检物等。若患者存在气管插管或切开，可插管后通过吸痰管抽取深部痰液。（2）肺外标本：根据感染部位采集，包括淋巴结穿刺液、胸腹水、脑脊液（CSF）、尿液、粪便、血液、病变组织活检标本等。采集脓液时应注意抽取深部脓液而非浅表分泌物，避免皮肤正常菌群污染。采集脑脊液时，建议抽取不少于3-5ml以提高阳性检出率。组织活检标本应置于无菌容器中，避免使用固定液，以免抑制细菌生长或影响DNA提取。2.2标本容器与标识所有标本必须置于无菌、防漏、且带有螺旋盖的专用容器中。容器外表面必须保持清洁，不得有残留体液。容器标签应包含唯一识别码（如条形码）、患者姓名、采集日期及时间、标本类型等信息。标签应具有防水、防擦拭功能，确保在运输及处理过程中信息清晰可读。2.3标本运输与生物安全标本运输必须遵循WHO及国家卫健委关于感染性物质运输的三层包装原则。A类感染性物质（如疑似耐药结核、脑膜炎结核标本）运输需严格执行UN2814标准，B类执行UN3373标准。运输过程中应配备足够的冷藏或冷冻材料，确保标本在规定温度下送达。严禁通过公共交通工具或邮寄方式运送未经灭活的结核分枝杆菌标本。2.4标本保存标本采集后应尽快送检。若无法在2小时内送达实验室，痰液等含菌量较高的标本可置于4℃冰箱保存，但不应超过7天。对于分子生物学检测标本，若需长期保存，应置于-20℃或-70℃环境。脑脊液等无菌部位标本应优先进行培养或分子检测，避免冷藏导致细菌活性下降。3涂片镜检法萋-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法和荧光染色法是发现传染源最快速、经济的方法，是结核病实验室网络的基础。3.1染色原理与操作要点抗酸染色利用结核分枝杆菌细胞壁富含分枝杆菌酸的特性，该物质与石炭酸复红结合后能抵抗盐酸酒精的脱色作用，最终呈现红色。荧光染色法使用金胺O或吖啶橙染料，在荧光显微镜下菌体呈现明亮的黄绿色荧光，便于快速筛查。操作过程中，涂片制备是关键。取痰液约0.05-0.1ml，在洁净玻片上均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形斑点，自然干燥后经固定处理。固定时火焰通过玻片背面3-5次，以手背触感温热而不烫为宜，避免过度加热导致细胞形态扭曲或炭化。3.2镜检标准与结果报告镜检时应采用“弓”字形轨迹移动玻片，观察不少于300个视野。为防止视觉疲劳，连续镜检时间不宜超过30分钟。结果报告应采用半定量分级标准，具体如下表所示：报告等级萋-尼氏染色法（油镜）荧光染色法（荧光镜）备注说明3+100个视野内见≥10条菌50个视野内见≥10条菌未见视野平均计数2+1-9条菌/100视野1-9条菌/50视野需换算平均每视野菌数1+10-99条菌/100视野10-99条菌/50视野-阴性（-）0条菌/300视野0条菌/50视野连续观察300个视野未见抗酸杆菌抗酸杆菌（AFB）未明确计数未明确计数仅报告未分级阳性，需复查3.3质量控制实验室需每日进行阴性、弱阳性及阳性对照片的染色。每批次染色应使用已知的阳性菌株（如H37Rv）作为质控。每季度需对保存的涂片进行随机抽检复阅，确保镜检结果的准确性。对于荧光染色阳性的涂片，原则上应使用萋-尼氏染色法进行复核确认，以排除非分枝杆菌产生的假阳性干扰。4分枝杆菌培养检查培养法是确诊结核病的“金标准”，不仅提供细菌学确诊依据，还可为后续药敏试验及分子生物学检测提供菌体。4.1培养基选择与制备（1）固体培养基：罗氏培养基（L-J）是传统标准培养基，含鸡蛋、天门冬素、甘油、孔雀绿等成分，孔雀绿可抑制杂菌生长。制备时应严格无菌操作，分装后斜面凝固需进行85℃间歇灭菌。为了提高阳性率，建议同时接种酸性罗氏培养基（含丙酮酸），适合牛型分枝杆菌生长。（2）液体培养基：目前主流采用分枝杆菌生长指示管（MGIT）系统，其含荧光标记的氧气感应剂。当细菌生长消耗管内氧气时，荧光强度增加，仪器自动报警。液体培养较固体培养检出时间缩短约1-2周，灵敏度显著提高。4.2标本前处理除无菌体液外，所有标本在接种前必须进行去污染处理，以杀灭杂菌并液化标本。推荐使用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠（NALC-NaOH）法。具体操作：取标本1-3ml加入等量处理液，涡旋振荡震荡15-30秒，室温静置15分钟（不超过20分钟，以免杀灭结核菌）。随后加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）至45-50ml，以3000×g离心15-20分钟。弃去上清液，沉淀物重悬于0.5-1mlPBS或无菌生理盐水中，分别接种至固体和液体培养基。4.3接种与培养环境（1）固体培养：接种后的L-J培养基斜面每支接种0.1ml，保持斜面湿润。置于37℃恒温培养箱内，含5%-10%CO2环境可促进生长。接种后第3天及第7天观察菌落生长情况，此后每周观察一次，直至第8周仍未生长者报告阴性。（2）液体培养：严格按照MGIT960系统操作规程，在无菌条件下向培养管中加入营养添加剂（OADC）及杂菌抑制剂（PANTA）。接种0.5ml处理后的标本，上机培养。仪器设定周期一般为42天。4.4菌落形态与结果判定结核分枝杆菌在L-J培养基上生长缓慢，典型菌落呈粗糙、菜花状、乳白色或米黄色，边缘不整齐。液体培养阳性时仪器会报警，需取培养物进行涂片镜检确认，排除污染或假阳性。若培养基出现表面潮湿、颜色改变或非典型菌落（如光滑、扁平、快速生长），应高度怀疑非结核分枝杆菌（NTM）污染或感染，需进行菌种鉴定。5分子生物学检查分子生物学检测是现代结核病诊断的核心技术，具有快速、灵敏、特异度高的特点，尤其适用于菌阴肺结核及肺外结核的诊断。5.1核酸扩增技术（1）实时荧光定量PCR（Real-timePCR）：针对结核分枝杆菌特异性基因片段（如IS6110、MPB64、16SrRNA）进行扩增与检测。实验室应制定严格的防污染措施，设置试剂准备区、标本制备区、扩增区及产物分析区。结果判读需结合Ct值及扩增曲线，对于灰区结果应进行复检。（2）恒温扩增技术：如环介导等温扩增（LAMP）或交叉引物等温扩增（CPA）。该技术仅需恒温水浴即可完成，无需昂贵的PCR仪，适合基层实验室快速筛查。5.2分子线性探针技术（Hain及GenoType）该技术主要用于耐药基因突变检测及菌种鉴定。操作流程包括PCR扩增生物素标记的产物，随后与固定在硝酸纤维素膜上的特异性探针进行杂交显色。（1）菌种鉴定：可区分结核分枝杆菌复合群与常见的非结核分枝杆菌（如鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等），指导临床精准用药。（2）耐药性检测：利福平：主要检测rpoB基因核心区（81bp利福平耐药决定区，RRDR）的突变。利福平：主要检测rpoB基因核心区（81bp利福平耐药决定区，RRDR）的突变。异烟肼：主要检测katG基因（S315T突变最常见）及inhA启动子区突变。异烟肼：主要检测katG基因（S315T突变最常见）及inhA启动子区突变。氟喹诺酮类：检测gyrA和gyrB基因突变。氟喹诺酮类：检测gyrA和gyrB基因突变。二线注射类药物：检测rrs和eis基因突变。二线注射类药物：检测rrs和eis基因突变。5.3GeneXpertMTB/RIF及Ultra系统该系统实现了全封闭、自动化的“标本进、结果出”检测流程。XpertMTB/RIF：可在2小时内直接从痰液中检出结核分枝杆菌及利福平耐药情况。灵敏度高于涂片镜检，接近固体培养。XpertMTB/RIF：可在2小时内直接从痰液中检出结核分枝杆菌及利福平耐药情况。灵敏度高于涂片镜检，接近固体培养。XpertMTB/RIFUltra：作为升级版，其检测限更低，增加了针对IS6110和mpb30的扩增靶标，对于菌阴肺结核及儿童结核的诊断效能显著提升，并能区分半定量载量（极低、低、中、高）。XpertMTB/RIFUltra：作为升级版，其检测限更低，增加了针对IS6110和mpb30的扩增靶标，对于菌阴肺结核及儿童结核的诊断效能显著提升，并能区分半定量载量（极低、低、中、高）。5.4全基因组测序（WGS）WGS是分子流行病学及耐药机制研究的最高级工具。通过对结核分枝杆菌进行全基因组测序，可以全面分析所有耐药相关基因的突变，预测表型药敏结果，准确度可达95%以上。同时，WGS通过进行聚类分析，可以精准追踪传染源，识别传播链条。2026版指南鼓励省级及以上结核病参比实验室建立WGS分析平台，并逐步将测序数据纳入国家结核病分子监测网络。6药物敏感性试验药敏试验是制定耐药结核病化疗方案的依据，分为表型药敏试验和基因型药敏试验。6.1表型药敏试验（液体与固体）（1）比例法：在含药培养基和无药培养基上接种相同量的菌液，计算含药培养基上生长的菌落数占无药培养基菌落数的百分比。若耐药百分比大于1%，判定为耐药。此方法操作相对简单，是传统药敏的金标准。（2）绝对浓度法：通过比较细菌在含不同浓度药物培养基上的生长情况，测定最低抑菌浓度（MIC）。虽然操作繁琐，但在特定药物临界浓度判定上具有参考价值。（3）液体培养药敏（MGIT960）：利用液体培养基中细菌生长导致荧光信号变化的原理，系统自动计算药敏结果。相比固体法，该方法turnaroundtime更短（约1-2周），且结果判定更为客观。2026版指南推荐将液体药敏作为一线抗结核药物及氟喹诺酮类药物的首选药敏方法。常用抗结核药物临界浓度参考表（固体培养基L-J）：药物名称药物浓度范围耐药临界浓度备注异烟肼(INH)0.1,1.0μg/ml1.0μg/ml低浓度耐药提示可能为低度耐药利福平(RFP)40,250μg/ml40μg/ml利福平耐药通常代表耐多药结核（MDR-TB）链霉素(SM)10,100μg/ml10μg/ml-乙胺丁醇(EMB)5,50μg/ml50μg/ml-吡嗪酰胺(PZA)25,100μg/ml100μg/ml需在pH5.5的酸性培养基中进行莫西沙星(MFX)0.25,2.0μg/ml2.0μg/ml氟喹诺酮类药物左氧氟沙星(LVX)1.0,4.0μg/ml4.0μg/ml-阿米卡星(AMK)10,40μg/ml40μg/ml注射类药物卷曲霉素(CPM)10,40μg/ml40μg/ml注射类药物6.2基因型药敏试验基因型药敏通过检测耐药相关基因的突变来推断耐药性。其优势在于快速（数小时至1天），但存在局限性：（1）无法检测未知的新突变位点。（2）基因型耐药与表型耐药有时存在不一致性（即表型敏感但基因突变，或表型耐药但未检出已知突变）。因此，基因型药敏结果必须结合表型药敏结果进行综合判读。对于利福平耐药，若rpoB基因未检出突变，需复核表型药敏，排除异质性耐药或罕见突变。6.3药敏试验的质量控制每批药敏试验必须包含标准敏感菌株（H37Rv）作为质控株。对于含药培养基，需定期监测药物的有效性。药敏结果异常（如全敏感但临床治疗无效，或全耐药但菌株污染）时，必须重复试验。7实验室生物安全与质量管理7.1实验室生物安全分级结核病检验必须在符合生物安全要求的实验室中进行。（1）BSL-2实验室：适用于涂片镜检、液体培养（封闭系统）、分子生物学检测（标本核酸提取需在生物安全柜中进行）。实验室需配备II级生物安全柜（BSC）、高压灭菌器、洗眼装置等。（2）BSL-3实验室：适用于结核分枝杆菌的大量活菌操作、菌种传代、产气溶胶的操作（如离心、研磨）、以及耐药菌株的全面药敏试验。BSL-3实验室需具备独立的通风系统、负压环境及严格的个人防护装备（PPE）要求。7.2个人防护与废弃物处理实验室人员进入实验区必须穿戴防护服、N95及以上级别的医用防护口罩、乳胶手套、护目镜或面屏。操作过程中严禁徒手触摸面部。所有实验废弃物（包括废液、废弃培养基、手套、口罩等）必须经高压灭菌（121℃，30分钟）后方可作为普通垃圾处理。锐器必须放入防刺穿容器中。7.3室内质量控制（IQC）（1）人员培训：检测人员必须经过专业培训并考核上岗，定期进行技能比对。（2）仪器设备：关键设备（显微镜、培养箱、PCR仪、生物安全柜）需定期维护、校准及性能验证。温湿度记录需每日监测。（3）试剂耗材：使用经国家药监局注册或WHO预评估的试剂。每批次试剂使用前需进行阴阳性对照测试。7.4室间质量评价（EQA）实验室必须定期参加国家或省级临检中心组织的室间质评计划。对于未覆盖的项目，应建立实验室间比对机制。每年至少进行一次第一轮与第二轮的盲样复测，涵盖涂片、培养、分子检测及药敏试验。对于EQA结果不满意的项次，必须进行根本原因分析并制定纠正预防措施（CAPA）。8结果报告与临床解读8.1报告原则检验报告应做到准确、及时、规范、完整。报告内容应包含患者基本信息、标本信息、检测方法、检测结果、参考范围、生物安全提示及必要的解释性备注。（1）涂片报告：应明确报告抗酸杆菌阳性级别及阴性结果。