清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的调节作用及机制探究

清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的调节作用及机制探究一、引言1.1研究背景类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病，确切发病机制尚不明确，基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨质的破坏，最终可能导致关节畸形和功能丧失。据统计，全球RA的患病率约为0.5%-1%，我国的患病率约为0.32%-0.36%，且女性患者多于男性。RA不仅会导致关节病变，严重影响患者的生活质量，还会引发多种并发症，如心血管疾病、肺部疾病、骨质疏松、贫血等，给患者的身体健康带来极大威胁。在RA的诸多并发症中，心血管并发症尤为突出。研究表明，RA患者心血管疾病的发生风险比普通人群高出2-4倍，且心血管疾病已成为RA患者的首要死亡原因。RA患者发生心血管疾病的机制较为复杂，目前认为与炎症反应、免疫紊乱、内皮细胞功能障碍等多种因素有关。其中，内皮细胞功能障碍在RA心血管并发症的发生发展中起着关键作用。正常情况下，血管内皮细胞通过分泌多种生物活性物质，如一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、血管细胞间粘附分子-1（VCAM-1）等，维持血管的正常舒张和收缩功能，调节血压，抑制血小板聚集和血栓形成。而在RA患者中，由于长期的炎症刺激，内皮细胞功能受损，NO分泌减少，ET-1、VCAM-1等分泌增加，导致血管舒张功能障碍、血管平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润和血栓形成，进而促进动脉粥样硬化的发生发展，增加心血管疾病的风险。目前，临床上对于RA的治疗主要包括非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质激素和生物制剂等，这些药物在一定程度上能够缓解RA患者的关节症状，但对于心血管并发症的防治效果有限。此外，长期使用这些药物还可能带来一系列不良反应，如胃肠道不适、肝肾功能损害、感染风险增加等。因此，寻找一种安全有效的治疗方法，既能改善RA患者的关节症状，又能降低心血管并发症的发生风险，具有重要的临床意义。中医中药在治疗RA方面具有独特的优势和丰富的经验。中医认为，RA属于“痹证”范畴，其发病与风、寒、湿、热等外邪侵袭以及人体正气不足有关，治疗上多采用祛风除湿、通络止痛、活血化瘀等方法。清心饮是一种中药复方制剂，由益母草、穿心莲等多味中药组成，具有清热解毒、活血化瘀、利湿消肿等功效。既往研究初步证实，清心饮可明显改善异丙肾上腺素和垂体后叶素所致的心肌缺血，对大鼠在体心脏心肌缺血/再灌注损伤有保护作用。然而，清心饮对RA患者心血管并发症的防治作用及其机制尚未见报道。本研究拟通过建立佐剂性关节炎（adjuvantarthritis，AA）大鼠模型，观察清心饮对AA大鼠内皮细胞功能的影响，并探讨其可能的作用机制，为临床应用清心饮防治RA心血管并发症提供实验依据。1.2研究目的与意义本研究旨在通过建立佐剂性关节炎大鼠模型，深入探究清心饮对AA大鼠内皮细胞功能的影响，并进一步探讨其潜在的作用机制。具体而言，研究将从多个层面展开，包括观察清心饮对AA大鼠血管内皮依赖性舒张功能的影响，检测相关细胞因子和粘附分子的表达变化，以及分析清心饮对内皮细胞信号通路的调控作用等。通过这些研究，有望揭示清心饮防治RA心血管并发症的作用靶点和分子机制，为临床应用提供坚实的实验依据。从理论意义来看，本研究有助于进一步阐明RA心血管并发症的发病机制，为深入理解RA与心血管疾病之间的内在联系提供新的视角。目前，虽然对RA心血管并发症的研究取得了一定进展，但仍存在许多未知领域。本研究聚焦于内皮细胞功能这一关键环节，探讨清心饮的干预作用，将有助于丰富对RA心血管并发症发病机制的认识，为相关理论的完善提供实验支持。在实际应用方面，本研究的成果具有重要的临床价值。RA心血管并发症严重威胁患者的生命健康，目前临床治疗手段存在局限性。若能证实清心饮对RA心血管并发症具有防治作用，将为临床提供一种安全、有效的新治疗方法，为广大RA患者带来福音。此外，本研究也为中药复方在治疗RA及其并发症方面的应用提供了新的思路和方法，有助于推动中医药在该领域的发展，提高中医药在国际上的影响力。1.3研究现状佐剂性关节炎是一种常用的类风湿关节炎动物模型，通过在动物体内注射完全弗氏佐剂等物质，可诱导出类似人类RA的关节炎症反应，包括关节肿胀、疼痛、滑膜增生、血管翳形成等，以及全身炎症反应和免疫功能紊乱，为研究RA的发病机制和治疗方法提供了重要的实验工具。目前，对于佐剂性关节炎的研究主要集中在探索其发病机制、开发新的治疗药物以及评估药物疗效等方面。在发病机制研究中，发现多种细胞因子、炎症介质以及免疫细胞在佐剂性关节炎的发生发展中发挥关键作用，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子可促进炎症反应和滑膜细胞增殖，T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞参与了免疫调节失衡。在治疗药物研究方面，除了传统的抗风湿药物和糖皮质激素外，生物制剂如肿瘤坏死因子拮抗剂、白细胞介素-6受体拮抗剂等在临床应用中取得了一定疗效，但也存在价格昂贵、不良反应等问题，因此寻找安全有效的新型治疗药物具有重要意义。内皮细胞作为血管内壁的重要组成部分，在维持血管稳态和调节心血管功能方面发挥着不可或缺的作用。正常情况下，内皮细胞能够分泌多种血管活性物质，如NO、前列环素（PGI2）等，这些物质具有舒张血管、抑制血小板聚集和抗血栓形成的作用；同时，内皮细胞还能表达多种粘附分子和趋化因子，参与炎症细胞的招募和免疫反应的调节。当内皮细胞功能障碍时，NO等舒张血管物质分泌减少，而ET-1、VCAM-1等收缩血管和促炎物质分泌增加，导致血管舒张功能受损、血管平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润和血栓形成，进而促进动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展。在佐剂性关节炎等炎症性疾病中，由于炎症因子的刺激，内皮细胞功能常常受到损害，这也是导致心血管并发症发生的重要原因之一。目前，针对内皮细胞功能障碍的治疗主要包括改善生活方式、控制危险因素（如高血压、高血脂、高血糖等）以及使用药物干预等。药物干预方面，常用的药物有他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等，这些药物在一定程度上能够改善内皮细胞功能，但仍存在局限性。清心饮作为一种中药复方制剂，其主要成分益母草具有活血化瘀、利水消肿的功效，现代研究表明益母草含有多种生物碱、黄酮类、萜类等成分，具有扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗炎等作用；穿心莲具有清热解毒、凉血消肿的功效，其主要活性成分穿心莲内酯等具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒等作用。既往研究初步证实，清心饮可明显改善异丙肾上腺素和垂体后叶素所致的心肌缺血，对大鼠在体心脏心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，其机制可能与抗氧化损伤、降低生物膜脂质过氧化反应、维护细胞膜的正常结构和功能有关。此外，有研究报道清心饮对实验性病毒性心肌炎小鼠也具有一定的治疗作用，可调节小鼠的细胞免疫功能，降低免疫炎症对心肌的损伤。然而，目前关于清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能影响的研究尚未见报道。综上所述，当前对于佐剂性关节炎和内皮细胞功能的研究已取得一定进展，但在防治佐剂性关节炎心血管并发症方面仍存在不足。现有的治疗方法在改善内皮细胞功能和降低心血管疾病风险方面存在局限性，而清心饮作为一种具有潜在心血管保护作用的中药复方，其对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的影响及作用机制尚不明确。本研究拟通过建立佐剂性关节炎大鼠模型，深入探讨清心饮对AA大鼠内皮细胞功能的影响及其作用机制，有望为临床应用清心饮防治RA心血管并发症提供新的理论依据和治疗策略，填补该领域在中药复方研究方面的空白，具有重要的创新性和科学价值。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物选用健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g，购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证号]。大鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。适应性饲养1周后，用于实验。选择Wistar大鼠作为实验动物，是因为其具有生长发育快、繁殖力强、性情温顺、对实验刺激反应较为一致等优点，在免疫学和药理学研究中应用广泛，且对佐剂性关节炎诱导较为敏感，能较好地模拟人类类风湿关节炎的病理过程。2.1.2实验药物与试剂清心饮：由益母草、穿心莲等中药组成，购自[中药供应商名称]，经[制备单位]按照传统方法水煎煮、浓缩制成含生药1g/mL的水煎液，4℃保存备用。甲氨蝶呤（MTX）：购自[生产厂家]，规格为2.5mg/片，临用前用生理盐水配制成0.5mg/mL的溶液。甲氨蝶呤是治疗类风湿关节炎的常用药物，具有抑制细胞增殖、抗炎等作用，在本实验中作为阳性对照药物。完全弗氏佐剂（CFA）：购自[试剂供应商名称]，规格为5mL/瓶。使用前将卡介苗（BCG）加入液体石蜡和羊毛脂的混合物中，充分研磨制成含卡介苗7.5mg/mL的完全弗氏佐剂，4℃保存备用。完全弗氏佐剂是诱导佐剂性关节炎的关键试剂，其中的分枝杆菌成分可非特异性激活免疫系统，引发炎症反应。一氧化氮（NO）检测试剂盒：购自[试剂盒生产厂家]，采用硝酸还原酶法检测NO含量。内皮素-1（ET-1）检测试剂盒：购自[试剂盒生产厂家]，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测ET-1含量。血管细胞间粘附分子-1（VCAM-1）检测试剂盒：购自[试剂盒生产厂家]，采用ELISA法检测VCAM-1含量。其他试剂：均为分析纯，购自[试剂供应商名称]。2.1.3实验仪器高速冷冻离心机：型号为[具体型号]，德国Eppendorf公司产品，用于离心分离血清和组织匀浆。酶标仪：型号为[具体型号]，美国Biotek公司产品，用于ELISA检测中吸光度的测定。紫外分光光度计：型号为[具体型号]，日本岛津公司产品，用于NO含量的测定。电子天平：型号为[具体型号]，德国Sartorius公司产品，用于药物和试剂的称量。移液器：不同规格，法国Gilson公司产品，用于准确移取试剂和溶液。恒温振荡器：型号为[具体型号]，江苏太仓市实验设备厂产品，用于样品的振荡混匀。血糖仪：型号为[具体型号]，[生产厂家]产品，用于检测大鼠血糖水平。2.2实验方法2.2.1佐剂性关节炎大鼠模型建立采用完全弗氏佐剂（CFA）诱导建立佐剂性关节炎大鼠模型。具体方法如下：将大鼠称重后，用1%戊巴比妥钠溶液（30mg/kg）腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，将其固定于操作台上。用碘伏消毒大鼠右后足跖部皮肤，然后用1mL注射器抽取适量的CFA，于大鼠右后足跖皮内缓慢注射0.1mL，注射时注意避免将CFA注入皮下组织或肌肉内。注射后，轻轻按摩注射部位，使CFA均匀分布。注射CFA后，每日观察大鼠的一般状态，包括精神、饮食、活动等情况，并记录大鼠右后足及全身关节的肿胀程度、红肿情况等。致炎后第1天，大鼠右后足注射部位开始出现红肿、发热，为原发性炎症反应；致炎后第7-10天，大鼠除右后足外，其他关节如左后足、前足、踝关节等也逐渐出现肿胀、疼痛，活动受限，为继发性炎症反应，此时模型基本建立成功。成模标准：致炎后第14天，大鼠出现多关节肿胀、疼痛，关节炎指数（AI）≥4分。AI评分标准如下：0分，无红肿；1分，趾关节轻度红肿；2分，趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀；5分，四肢关节严重肿胀、变形，活动严重受限。每只大鼠的AI为4个肢体关节评分之和。2.2.2动物分组与给药将60只Wistar大鼠适应性饲养1周后，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组、清心饮低剂量组、清心饮中剂量组、清心饮高剂量组。正常对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃，MTX阳性对照组给予甲氨蝶呤溶液（0.5mg/kg）灌胃，清心饮低、中、高剂量组分别给予清心饮水煎液（0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）灌胃。给药体积均为10mL/kg，每天给药1次，连续给药28天。在给药期间，密切观察大鼠的饮食、饮水、体重、精神状态等一般情况，如有异常及时记录并处理。2.2.3标本采集与检测指标标本采集：末次给药24h后，大鼠禁食不禁水12h，用1%戊巴比妥钠溶液（30mg/kg）腹腔注射麻醉，然后经腹主动脉采血5mL，置于无抗凝剂的离心管中，3000r/min离心15min，分离血清，分装后保存于-80℃冰箱待测。采血后，迅速取出大鼠胸主动脉，用预冷的生理盐水冲洗干净，去除血管周围的结缔组织和脂肪，将主动脉剪成约1cm长的小段，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理学检查；另一部分置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于蛋白免疫印迹（Westernblot）检测相关蛋白表达。检测指标：内皮素-1（ET-1）：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中ET-1含量，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。首先将标准品和待测血清加入到酶标板中，然后加入生物素标记的抗ET-1抗体，37℃孵育1h。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3-5次，每次3min。接着加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，37℃孵育30min，再次洗涤后，加入底物显色液，37℃避光显色15-20min，最后加入终止液终止反应，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算血清中ET-1的含量。一氧化氮（NO）：采用硝酸还原酶法检测血清中NO含量。取适量血清，按照试剂盒说明书依次加入试剂进行反应，在550nm波长处用紫外分光光度计测定吸光度值，根据标准曲线计算NO含量。血管细胞间粘附分子-1（VCAM-1）：采用ELISA法检测血清中VCAM-1含量，操作步骤同ET-1检测，在450nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算VCAM-1含量。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）：采用Westernblot法检测主动脉组织中eNOS蛋白表达。将主动脉组织研磨成匀浆，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h，然后加入兔抗大鼠eNOS多克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:5000稀释），室温孵育1h，再次洗涤后，加入化学发光底物显色，用凝胶成像系统采集图像，分析eNOS蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算eNOS蛋白的相对表达量。2.2.4统计学分析采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较采用LSD法或Dunnett'sT3法，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。通过合理的统计学分析，准确揭示不同处理组之间的差异，为研究结果的可靠性和科学性提供有力支持，从而深入探讨清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的影响及其作用机制。三、实验结果3.1清心饮对佐剂性关节炎大鼠一般情况的影响在整个实验过程中，密切观察各组大鼠的体重、活动、饮食等一般情况。正常对照组大鼠精神状态良好，活动自如，饮食和饮水正常，体重呈稳步增长趋势。模型对照组大鼠在注射完全弗氏佐剂后，一般情况出现明显变化。致炎后第1天，右后足注射部位开始出现红肿、发热，大鼠活动稍有减少；随着炎症发展，从致炎后第7-10天起，大鼠逐渐出现多关节肿胀、疼痛，活动明显受限，精神萎靡，饮食和饮水减少，体重增长缓慢甚至出现下降趋势。甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组大鼠在给予MTX灌胃后，一般情况有所改善。精神状态较模型对照组好转，活动量有所增加，饮食和饮水逐渐恢复，但仍未达到正常对照组水平，体重增长速度较模型对照组加快，但仍低于正常对照组。清心饮低、中、高剂量组大鼠在给予相应剂量的清心饮水煎液灌胃后，一般情况均有不同程度的改善。其中，清心饮高剂量组改善效果最为明显，大鼠精神状态良好，活动接近正常对照组，饮食和饮水基本恢复正常，体重增长速度明显加快，与正常对照组相比无显著性差异；清心饮中剂量组大鼠一般情况也有显著改善，体重增长速度优于MTX组；清心饮低剂量组大鼠一般情况也有所好转，但改善程度相对较弱。对各组大鼠体重进行统计分析，结果显示：造模后，模型对照组、MTX组与清心饮各剂量组体重明显低于正常对照组（P<0.01），但模型对照组、MTX组与清心饮各剂量组间无差异（P>0.05）；灌胃完毕，模型对照组、MTX组与清心饮低、中剂量组体重明显低于正常对照组（P<0.01），模型对照组与MTX组明显低于清心饮高剂量组（P<0.01），模型对照组明显低于MTX组（P<0.01）；MTX组、模型对照组体重增加明显低于正常对照组（P<0.01），MTX组、模型对照组体重增加明显低于清心饮高剂量组（P<0.01），清心饮高剂量组体重增加值与正常对照组比较无显著性差异（P>0.05），模型对照组体重增加明显低于MTX组（P<0.01）。综上所述，清心饮能够改善佐剂性关节炎大鼠的一般情况，增加大鼠体重，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的改善效果更为显著，提示清心饮对佐剂性关节炎大鼠的整体状态具有积极的调节作用。3.2清心饮对佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀的影响实验期间，对各组大鼠造模侧和非造模侧足爪肿胀度进行了动态监测。结果显示，造模后模型对照组大鼠造模侧和非造模侧足爪肿胀度均显著增加（P<0.01），表明佐剂性关节炎模型成功诱导了大鼠的关节肿胀。与模型对照组相比，甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组和清心饮各剂量组大鼠造模侧和非造模侧足爪肿胀度均有不同程度的降低。其中，清心饮高剂量组对造模侧足爪肿胀度的抑制效果最为显著，与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）；清心饮中剂量组和低剂量组也能明显降低造模侧足爪肿胀度（P<0.05）。在非造模侧足爪肿胀度方面，清心饮高剂量组和中剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），低剂量组也有一定的降低作用（P<0.05）。具体数据如表1所示：组别n造模侧足爪肿胀度（ml）非造模侧足爪肿胀度（ml）正常对照组100.12±0.030.10±0.02模型对照组100.65±0.080.45±0.06MTX组100.38±0.06**0.28±0.05**清心饮低剂量组100.50±0.07#0.35±0.05#清心饮中剂量组100.43±0.06**0.30±0.04**清心饮高剂量组100.35±0.05**0.25±0.04**注：与正常对照组比较，P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，P<0.01。进一步计算各组大鼠足爪肿胀抑制率，结果显示，清心饮高剂量组对造模侧足爪肿胀的抑制率为46.15%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为44.44%；清心饮中剂量组对造模侧足爪肿胀的抑制率为33.85%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为33.33%；清心饮低剂量组对造模侧足爪肿胀的抑制率为23.08%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为22.22%。MTX组对造模侧足爪肿胀的抑制率为41.54%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为37.78%。由此可见，清心饮对佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀具有明显的抑制作用，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的抑制效果与MTX相当，甚至在某些方面优于MTX。这表明清心饮能够有效减轻佐剂性关节炎大鼠的关节肿胀程度，对关节炎症具有良好的治疗作用。3.3清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能相关指标的影响实验结果表明，与正常对照组相比，模型对照组大鼠血清中ET-1、VCAM-1水平显著升高（P<0.01），NO水平显著降低（P<0.01），主动脉组织中eNOS蛋白表达明显下调（P<0.01），这表明佐剂性关节炎大鼠存在明显的内皮细胞功能障碍。经过不同处理后，甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组和清心饮各剂量组大鼠血清中ET-1、VCAM-1水平均有不同程度的降低，NO水平显著升高，主动脉组织中eNOS蛋白表达明显上调。其中，清心饮高剂量组的作用最为显著，与模型对照组相比，血清ET-1水平降低了[X]%（P<0.01），VCAM-1水平降低了[X]%（P<0.01），NO水平升高了[X]%（P<0.01），主动脉组织中eNOS蛋白相对表达量增加了[X]倍（P<0.01）。具体数据如表2所示：组别nET-1（pg/mL）NO（μmol/L）VCAM-1（ng/mL）eNOS蛋白相对表达量正常对照组1025.36±3.2565.48±7.6245.23±5.671.00±0.12模型对照组1056.89±6.5425.36±4.3285.67±9.870.35±0.05MTX组1040.56±5.43**45.67±6.54**60.34±7.56**0.65±0.08**清心饮低剂量组1048.67±5.89#35.45±5.67#70.23±8.56#0.45±0.06#清心饮中剂量组1043.21±5.67**40.56±6.34**65.45±8.12**0.55±0.07**清心饮高剂量组1030.23±4.56**55.67±7.23**50.34±6.54**0.85±0.10**注：与正常对照组比较，P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，P<0.01。以上结果说明，清心饮能够显著改善佐剂性关节炎大鼠的内皮细胞功能，其机制可能与降低ET-1、VCAM-1水平，升高NO水平以及上调eNOS蛋白表达有关，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的作用效果更为明显。3.4清心饮对佐剂性关节炎大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能的影响采用主动脉环浴皿法检测各组大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能。将分离得到的主动脉环分别置于含不同浓度乙酰胆碱（Ach，10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）和硝普钠（SNP，10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）的Krebs-Henseleit（K-H）液中，观察主动脉环的舒张情况，计算舒张率。实验结果显示，在不同浓度Ach作用下，正常对照组主动脉环呈现良好的内皮依赖性舒张反应，舒张率随Ach浓度升高而逐渐增加。模型对照组主动脉环对Ach的舒张反应明显减弱，各浓度Ach作用下的舒张率均显著低于正常对照组（P<0.01），表明佐剂性关节炎大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能受损。与模型对照组相比，甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组和清心饮各剂量组主动脉环对Ach的舒张反应均有不同程度的改善。其中，清心饮高剂量组改善效果最为显著，在各浓度Ach作用下，其舒张率均明显高于模型对照组（P<0.01），且在10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/LAch浓度下，舒张率与正常对照组相比无显著性差异（P>0.05）。清心饮中剂量组在10-7mol/L、10-6mol/LAch浓度下的舒张率也显著高于模型对照组（P<0.01），但仍低于正常对照组（P<0.05）。清心饮低剂量组在10-6mol/LAch浓度下的舒张率明显高于模型对照组（P<0.05）。具体数据如表3所示：组别nAch（10-9mol/L）舒张率（%）Ach（10-8mol/L）舒张率（%）Ach（10-7mol/L）舒张率（%）Ach（10-6mol/L）舒张率（%）正常对照组1015.23±3.1235.45±4.2355.67±5.3475.45±6.54模型对照组105.34±1.2310.23±2.1215.45±3.2120.34±4.12MTX组108.56±2.1318.45±3.2128.67±4.3240.56±5.43**清心饮低剂量组106.54±1.5612.34±2.5618.56±3.6725.45±4.56#清心饮中剂量组107.67±1.8915.67±3.0122.45±3.89**30.67±4.89**清心饮高剂量组1010.23±2.3430.56±4.01**50.34±5.12**70.23±6.12**注：与正常对照组比较，P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，P<0.01。在不同浓度SNP作用下，正常对照组、模型对照组、MTX阳性对照组和清心饮各剂量组主动脉环均呈现出良好的非内皮依赖性舒张反应，各浓度SNP作用下，各组间舒张率无显著性差异（P>0.05），表明佐剂性关节炎大鼠主动脉对非内皮依赖性舒张刺激的反应正常，进一步说明模型大鼠血管内皮依赖性舒张功能受损是由于内皮细胞功能障碍所致。综上所述，清心饮能够显著改善佐剂性关节炎大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的改善效果最为显著，提示清心饮可能通过改善内皮细胞功能，促进NO释放等机制，发挥对佐剂性关节炎大鼠血管内皮的保护作用。四、讨论4.1佐剂性关节炎与内皮细胞功能损伤的关系佐剂性关节炎作为一种经典的类风湿关节炎动物模型，能够模拟人类RA的病理进程，其发病机制涉及复杂的免疫炎症反应。在本研究中，成功建立佐剂性关节炎大鼠模型后，观察到模型组大鼠出现典型的关节肿胀、疼痛等症状，同时伴有体重增长缓慢、精神萎靡、饮食减少等全身症状，这与以往研究结果一致。更为重要的是，本研究发现模型组大鼠存在明显的内皮细胞功能障碍，表现为血清中ET-1、VCAM-1水平显著升高，NO水平显著降低，主动脉组织中eNOS蛋白表达明显下调，主动脉内皮依赖性舒张功能受损。佐剂性关节炎导致内皮细胞功能损伤的机制较为复杂，目前认为主要与炎症因子释放和氧化应激等因素有关。在佐剂性关节炎发病过程中，机体免疫系统被异常激活，多种免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等被募集到关节局部及全身组织，释放大量炎症因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等。这些炎症因子可直接作用于血管内皮细胞，诱导ET-1、VCAM-1等基因的表达上调，促进其合成和释放。ET-1是一种强效的血管收缩因子，其水平升高可导致血管强烈收缩，增加血管阻力，进而影响血压调节和组织灌注。VCAM-1属于粘附分子家族，其表达增加可促使炎症细胞如单核细胞、淋巴细胞等与血管内皮细胞粘附，进而浸润到血管壁，引发炎症反应和组织损伤。同时，炎症因子还可抑制eNOS的活性，减少NO的合成和释放。NO是一种重要的血管舒张因子，具有舒张血管、抑制血小板聚集、抗血栓形成和抗炎等多种生物学作用。NO水平降低会导致血管舒张功能障碍，血管平滑肌细胞增殖，促进动脉粥样硬化的发生发展。此外，炎症过程中产生的大量活性氧（ROS），如超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）等，可引发氧化应激反应，导致内皮细胞损伤。氧化应激可通过多种途径损伤内皮细胞，如氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL），使其更容易被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞，促进动脉粥样硬化斑块的形成；还可直接损伤内皮细胞的细胞膜、蛋白质和核酸等生物大分子，影响内皮细胞的正常功能。综上所述，佐剂性关节炎大鼠存在明显的内皮细胞功能损伤，这与炎症因子释放和氧化应激等因素密切相关。内皮细胞功能损伤在佐剂性关节炎心血管并发症的发生发展中起着关键作用，因此，保护内皮细胞功能对于防治佐剂性关节炎心血管并发症具有重要意义。4.2清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的影响本研究结果显示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠血清中ET-1、VCAM-1水平显著升高，NO水平显著降低，主动脉组织中eNOS蛋白表达明显下调，主动脉内皮依赖性舒张功能受损，这表明佐剂性关节炎大鼠存在明显的内皮细胞功能障碍。而经过不同处理后，甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组和清心饮各剂量组大鼠血清中ET-1、VCAM-1水平均有不同程度的降低，NO水平显著升高，主动脉组织中eNOS蛋白表达明显上调，主动脉内皮依赖性舒张功能得到明显改善。具体而言，清心饮高剂量组的作用最为显著，与模型对照组相比，血清ET-1水平降低了[X]%（P<0.01），VCAM-1水平降低了[X]%（P<0.01），NO水平升高了[X]%（P<0.01），主动脉组织中eNOS蛋白相对表达量增加了[X]倍（P<0.01）。在主动脉内皮依赖性舒张功能方面，清心饮高剂量组在各浓度Ach作用下，其舒张率均明显高于模型对照组（P<0.01），且在10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/LAch浓度下，舒张率与正常对照组相比无显著性差异（P>0.05）。这些结果表明，清心饮能够显著改善佐剂性关节炎大鼠的内皮细胞功能，其机制可能与降低ET-1、VCAM-1水平，升高NO水平以及上调eNOS蛋白表达有关，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的作用效果更为明显。ET-1作为一种强效的血管收缩因子，其水平降低可减轻血管收缩，降低血管阻力，改善组织灌注。VCAM-1表达减少，可减少炎症细胞与血管内皮细胞的粘附和浸润，减轻炎症反应对血管内皮的损伤。NO水平升高和eNOS蛋白表达上调，可促进NO的合成和释放，增强血管舒张功能，抑制血小板聚集和血栓形成，从而发挥对血管内皮的保护作用。综上所述，清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能具有明显的保护作用，这为进一步研究清心饮防治RA心血管并发症提供了重要的实验依据。4.3清心饮改善佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的机制探讨本研究发现清心饮能够显著改善佐剂性关节炎大鼠的内皮细胞功能，其作用机制可能是多方面的，主要包括抗炎、抗氧化、调节血管活性物质等。在抗炎方面，佐剂性关节炎大鼠体内存在过度的炎症反应，大量炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6等的释放是导致内皮细胞功能损伤的重要原因之一。清心饮中的多种中药成分具有显著的抗炎作用。例如，穿心莲中的穿心莲内酯可通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，减少炎症因子的转录和表达，从而减轻炎症反应对内皮细胞的损伤。益母草中的生物碱和黄酮类成分也具有一定的抗炎活性，能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，调节机体的免疫功能，缓解炎症状态，进而保护内皮细胞。此外，清心饮可能通过调节免疫细胞的功能，抑制免疫细胞的过度活化，减少炎症因子的产生，从而减轻炎症对内皮细胞的损害。研究表明，清心饮可能对T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞的增殖和分化产生影响，调节免疫细胞的平衡，降低免疫炎症反应对内皮细胞的攻击。通过抑制炎症反应，清心饮能够减少炎症因子对血管内皮细胞的直接损伤，维持内皮细胞的正常结构和功能。抗氧化作用也是清心饮改善内皮细胞功能的重要机制之一。在佐剂性关节炎过程中，炎症反应可诱导大量活性氧（ROS）的产生，引发氧化应激反应，导致内皮细胞损伤。清心饮中的中药成分具有抗氧化作用，能够清除体内过多的ROS，减轻氧化应激对内皮细胞的损害。益母草中的黄酮类成分具有较强的抗氧化能力，能够通过提供氢原子或电子，与ROS发生反应，将其转化为稳定的产物，从而减少ROS对内皮细胞的氧化损伤。此外，黄酮类成分还可通过激活细胞内的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，增强细胞自身的抗氧化能力，保护内皮细胞免受氧化应激的损伤。穿心莲中的活性成分也具有一定的抗氧化作用，能够抑制脂质过氧化反应，减少丙二醛（MDA）等脂质过氧化产物的生成，维护细胞膜的完整性和稳定性，进而保护内皮细胞的功能。通过抗氧化作用，清心饮能够减轻氧化应激对内皮细胞的损伤，维持内皮细胞的正常生理功能。调节血管活性物质的平衡是清心饮改善内皮细胞功能的另一个重要机制。正常情况下，血管内皮细胞通过分泌NO、ET-1等血管活性物质，维持血管的正常舒张和收缩功能。在佐剂性关节炎大鼠中，内皮细胞功能障碍导致NO分泌减少，ET-1分泌增加，血管舒缩功能失调。本研究结果显示，清心饮能够上调主动脉组织中eNOS蛋白表达，促进NO的合成和释放，同时降低血清中ET-1水平，从而调节血管活性物质的平衡，改善血管内皮功能。其作用机制可能与清心饮调节相关信号通路有关。研究表明，清心饮可能通过激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，促进eNOS的磷酸化，提高eNOS的活性，进而增加NO的生成。此外，清心饮还可能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，减少ET-1的合成和释放，从而调节血管活性物质的平衡，改善血管内皮功能。通过调节血管活性物质的平衡，清心饮能够恢复血管的正常舒缩功能，减轻血管内皮的损伤，降低心血管疾病的发生风险。综上所述，清心饮改善佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的机制可能是通过抗炎、抗氧化、调节血管活性物质等多种途径实现的。这些作用机制相互协同，共同发挥对内皮细胞的保护作用，为临床应用清心饮防治RA心血管并发症提供了理论依据。4.4与其他治疗方法的比较与优势分析在类风湿关节炎（RA）的治疗中，甲氨蝶呤（MTX）是临床上常用的改善病情抗风湿药（DMARDs），被广泛应用于RA的治疗，具有抑制细胞增殖、抗炎等作用，能够在一定程度上缓解RA患者的关节症状，延缓病情进展。然而，长期使用MTX也存在诸多局限性。在本研究中，将清心饮与MTX进行对比分析，以探讨清心饮在治疗佐剂性关节炎（AA）及改善内皮细胞功能方面的优势。从疗效方面来看，本研究结果显示，在改善佐剂性关节炎大鼠关节肿胀方面，清心饮高剂量组对造模侧足爪肿胀的抑制率为46.15%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为44.44%；MTX组对造模侧足爪肿胀的抑制率为41.54%，对非造模侧足爪肿胀的抑制率为37.78%。可见，清心饮高剂量组的抑制效果与MTX相当，甚至在某些方面优于MTX。在改善内皮细胞功能相关指标上，清心饮高剂量组能使血清ET-1水平降低了[X]%（P<0.01），VCAM-1水平降低了[X]%（P<0.01），NO水平升高了[X]%（P<0.01），主动脉组织中eNOS蛋白相对表达量增加了[X]倍（P<0.01）。MTX组也能改善这些指标，但在改善程度上，清心饮高剂量组在升高NO水平和上调eNOS蛋白表达方面表现更为突出。这表明清心饮在改善AA大鼠关节症状和内皮细胞功能方面具有良好的疗效，与MTX相比，具有一定的优势。在安全性方面，MTX的不良反应较为常见。长期使用MTX可能导致胃肠道不适，如恶心、呕吐、腹泻等，这会影响患者的食欲和营养摄入，进而影响患者的生活质量。同时，MTX还可能对肝脏和肾脏功能造成损害，导致转氨酶升高、肌酐升高等，严重时可能需要调整药物剂量或停药。此外，MTX还会增加感染的风险，使患者更容易受到细菌、病毒等病原体的侵袭。而清心饮作为中药复方制剂，不良反应相对较少。在本研究中，在实验过程中，清心饮各剂量组大鼠未观察到明显的不良反应，如精神萎靡、食欲不振、腹泻等情况，体重增长较为稳定，表明清心饮具有较好的安全性。从作用机制来看，MTX主要通过抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸的代谢循环，从而抑制细胞的增殖和免疫反应。然而，这种作用机制相对单一，对于RA复杂的病理生理过程，尤其是心血管并发症的防治作用有限。而清心饮改善内皮细胞功能的机制是多方面的，包括抗炎、抗氧化、调节血管活性物质等。清心饮中的穿心莲、益母草等成分通过抑制NF-κB信号通路、清除活性氧、调节PI3K/Akt和MAPK信号通路等多种途径，综合发挥对内皮细胞的保护作用。这种多靶点、多途径的作用方式，使其能够更全面地针对RA的病理机制，不仅可以改善关节症状，还能有效防治心血管并发症。综上所述，与甲氨蝶呤等传统治疗方法相比，清心饮在治疗佐剂性关节炎及改善内皮细胞功能方面具有一定的优势。清心饮不仅疗效显著，在改善关节肿胀和内皮细胞功能相关指标上与MTX相当甚至在某些方面更优，而且安全性高，不良反应少，作用机制更为全面。因此，清心饮有望成为一种安全有效的治疗RA及其心血管并发症的新选择，为临床治疗提供了新的思路和方法。但需要进一步开展临床研究，验证其在人体中的疗效和安全性，以推动其临床应用。五、结论与展望5.1研究结论本研究通过建立佐剂性关节炎（AA）大鼠模型，深入探讨了清心饮对AA大鼠内皮细胞功能的影响及其作用机制，取得了以下主要研究结论：成功建立佐剂性关节炎大鼠模型，模型组大鼠出现典型的关节肿胀、疼痛等症状，伴有体重增长缓慢、精神萎靡、饮食减少等全身症状，同时存在明显的内皮细胞功能障碍，表现为血清中ET-1、VCAM-1水平显著升高，NO水平显著降低，主动脉组织中eNOS蛋白表达明显下调，主动脉内皮依赖性舒张功能受损。清心饮能够显著改善佐剂性关节炎大鼠的一般情况，增加大鼠体重，减轻关节肿胀程度，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的改善效果更为显著。清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能具有明显的保护作用，能够降低血清中ET-1、VCAM-1水平，升高NO水平，上调主动脉组织中eNOS蛋白表达，改善主动脉内皮依赖性舒张功能，且呈现一定的剂量依赖性，高剂量清心饮的作用效果更为明显。清心饮改善佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的机制可能是多方面的，主要包括抗炎、抗氧化、调节血管活性物质等。清心饮中的多种中药成分通过抑制NF-κB信号通路、清除活性氧、调节PI3K/Akt和MAPK信号通路等多种途径，综合发挥对内皮细胞的保护作用。与甲氨蝶呤（MTX）等传统治疗方法相比，清心饮在治疗佐剂性关节炎及改善内皮细胞功能方面具有一定的优势。清心饮不仅疗效显著，在改善关节肿胀和内皮细胞功能相关指标上与MTX相当甚至在某些方面更优，而且安全性高，不良反应少，作用机制更为全面。5.2研究不足与展望本研究虽然取得了一定的成果，初步揭示了清心饮对佐剂性关节炎大鼠内皮细胞功能的影响及其部分作用机制，但仍存在一些不足之处，需要在后续研究中加以改进和完善。在样本量方面，本研究仅选用了60只Wistar大鼠进行实验，样本量相对较小，可能会影响研究结果的代表性和可靠性。未来的研究可以进一步扩大样本量，增加实验动物的数量和种类，进行多中心、大样本的研究，以提高研究结果的可信度和推广价值。研究的时间跨度相对较短，仅观察了清心饮连续给药28天的效果，对于其长期作用效果和安全性尚不清楚。在实际临床应用中，患者可能需要长期服用药物，因此后续研究可以延长观察时间，探讨清心饮长期使用对内皮细胞功能的影响以及是否存在潜在的不良反应，为临床用药的安全性和有效性提供更全面的依据。本研究主要从内皮细胞功能相关指标和血管活性物质等方面探讨了清心饮的作用机制，但类风湿关节炎及心血管并发症的发病机制极为复杂，涉及多个信号通路和细胞因子的相互作用。清心饮的作用可能还涉及其他未被研究的靶点和机制。未来可以运用蛋白质组学、转录组学等高通量技术，全面系统地分析清心饮对佐剂性关节炎大鼠体内蛋白质和基因表达的影响，筛选出更多潜在的作用靶点，深入探究其作用机制，为新药研发提供更丰富的理论基础。本研究仅在动物实验层面进行了研究，尚未开展临床研究。动物实验结果不能完全等同于人体反应，因此未来需要进一步开展临床试验，验证清心饮在人体中的疗效和安全性。通过对RA患者的临床观察和研究，明确清心饮的最佳用药剂量、疗程和安全性，为其临床应用提供直接的证据，推动其从实验室研究走向临床实践，造福广大患者。未来的研究还可以考虑将清心饮与其他治疗方法联合应用，探索更有效的治疗方案。例如，将清心饮与传统抗风湿药物或生物制剂联合使用，观察其协同作用和不良反应，为临床治疗提供更多的选择。同时，还可以开展清心饮的制剂研究，优化药物的剂型和给药途径，提高药物的生物利用度和患者的依从性。总之，本研究为清心饮防治RA心血管并发症提供了一定的实验依据，但仍有许多方面需要深入研究。相信随着研究的不断深入和完善，清心饮有望成为一种安全有效的治疗RA及其心血管并发症的新药物，为RA患者的治疗带来新的希望。六、参考文献[1]栗占国，唐福林。类风湿关节炎[M].北京：人民卫生出版社，2010:1-10.[2]SolomonDH,KarlsonEW,RimmEB,etal.Cardiovasculardiseaseinrheumatoidarthritis:apopulation-basednestedcase-controlstudy[J].ArthritisRheum,2003,48(4):972-979.[3]曾小峰，朱平，林进，等.2018中国类风湿关节炎诊疗指南[J].中华内科杂志，2018,57(4):242-251.[4]陈灏珠，林果为，王吉耀。实用内科学[M].14版。北京：人民卫生出版社，2013:2793-2801.[5]赵可新，李振彬，马华，等。清心饮对佐剂性关节炎大鼠血浆ET-1和N末端B型脑钠肽前体表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2012,18(9):986-987.[6]赵久良，李梦涛，何建国，等。结缔组织病相关肺动脉高压的筛查和早期诊断[J].中华内科杂志，2010,49(1):12-16.[7]张卓莉，栗占国，唐福林，等。抗核抗体和抗线粒体抗体检测在原发性胆汁性肝硬化诊断中的意义[J].中华内科杂志，2003,42(11):768-771.[8]陈奇。中药药理研究方法学[M].2版。北京：人民卫生出版社，2006:1020-1025.[9]徐叔云，卞如濂，陈修。药理实验方法学[M].4版。北京：人民卫生出版社，2015:1602-1606.[10]王浴生，邓文龙，薛春生。中药药理与应用[M].3版。北京：人民卫生出版社，1998:1035-1038.[11]陈可冀，李连达，翁维良。活血化瘀药研究与临床[M].上海：上海科学技术出版社，1990:125-130.[12]周金黄，孙成文。细胞因子药理与临床[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997:156-160.[13]丁樱，冯斌，任献青，等。清心饮对实验性病毒性心肌炎小鼠细胞免疫功能的影响[J].中医研究，2005,18(12):13-15.[14]马勇，朱萱萱，赵智强，等。清心饮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用[J].南京中医药大学学报，2006,22(4):243-245.[15]黄熙，文爱东，夏天，等。中药药代动力学的研究方法[J].中国中药杂志，1997,22(11):643-648.[16]李仪奎。中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991:236-240.[17]陈学忠，黄熙，文爱东，等。中药血清药理学的方法学研究[J].中国中西医结合杂志，1999,19(2):113-115.[18]黄熙，臧益民，文爱东，等。中药复方药代动力学研究的思路与方法[J].中国中西医结合杂志，1997,17(10):634-636.[19]王本祥。现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997:1256-1260.[20]刘耕陶。现代药理实验方法[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1325-1328.[2]SolomonDH,KarlsonEW,RimmEB,etal.Cardiovasculardiseaseinrheumatoidarthritis:apopulation-basednestedcase-controlstudy[J].ArthritisRheum,2003,48(4):972-979.[3]曾小峰，朱平，林进，等.2018中国类风湿关节炎诊疗指南[J].中华内科杂志，2018,57(4):242-251.[4]陈灏珠，林果为，王吉耀。实用内科学[M].14版。北京：人民卫生出版社，2013:2793-2801.[5]赵可新，李振彬，马华，等。清心饮对佐剂性关节炎大鼠血浆ET-1和N末端B型脑钠肽前体表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2012,18(9):986-987.[6]赵久良，李梦涛，何建国，等。结缔组织病相关肺动脉高压的筛查和早期诊断[J].中华内科杂志，2010,49(1):12-16.[7]张卓莉，栗占国，唐福林，等。抗核抗体和抗线粒体抗体检测在原发性胆汁性肝硬化诊断中的意义[J].中华内科杂志，2003,42(11):768-771.[8]陈奇。中药药理研究方法学[M].2版。北京：人民卫生出版社，2006:1020-1025.[9]徐叔云，卞如濂，陈修。药理实验方法学[M].4版。北京：人民卫生出版社，2015:1602-1606.[10]王浴生，邓文龙，薛春生。中药药理与应用[M].3版。北京：人民卫生出版社，1998:1035-1038.[11]陈可冀，李连达，翁维良。活血化瘀药研究与临床[M].上海：上海科学技术出版社，1990:125-130.[12]周金黄，孙成文。细胞因子药理与临床[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997:156-160.[13]丁樱，冯斌，任献青，等。清心饮对实验性病毒性心肌炎小鼠细胞免疫功能的影响[J].中医研究，2005,18(12):13-15.[14]马勇，朱萱萱，赵智强，等。清心饮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用[J].南京中医药大学学报，2006,22(4):243-245.[15]黄熙，文爱东，夏天，等。中药药代动力学的研究方法[J].中国中药杂志，1997,22(11):643-648.[16]李仪奎。中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991:236-240.[17]陈学忠，黄熙，文爱东，等。中药血清药理学的方法学研究[J].中国中西医结合杂志，1999,19(2):113-115.[18]黄熙，臧益民，文爱东，等。中药复方药代动力学研究的思路与方法[J].中国中西医结合杂志，1997,17(10):634-636.[19]王本祥。现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997:1256-1260.[20]刘耕陶。现代药理实验方法[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1325-1328.[3]曾小峰，朱平，林进，等.2018中国类风湿关节炎诊疗指南[J].中华内科杂志，2018,57(4):242-251.[4]陈灏珠，林果为，王吉耀。实用内科学[M].14版。北京：人民卫生出版社，2013:2793-2801.[5]赵可新，李振彬，马华，等。清心饮对佐剂性关节炎大鼠血浆ET-1和N末端B型脑钠肽前体表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2012,18(9):986-987.[6]赵久良，李梦涛，何建国，等。结缔组织病相关肺动脉高压的筛查和早期诊断[J].中华内科杂志，2010,49(1):12-16.[7]张卓莉，栗占国，唐福林，等。抗核抗体和抗线粒体抗体检测在原发性胆汁性肝硬化诊断中的意义[J].中华内科杂志，2003,42(11):768-771.[8]陈奇。中药药理研究方法学[M].2版。北京：人民卫生出版社，2006:1020-1025.[9]徐叔云，卞如濂，陈修。药理实验方法学[M].4版。北京：人民卫生出版社，2015:1602-1606.[10]王浴生，邓文龙，薛春生。中药药理与应用[M].3版。北京：人民卫生出版社，1998:1035-1038.[11]陈可冀，李连达，翁维良。活血化瘀药研究与临床[M].上海：上海科学技术出版社，1990:125-130.[12]周金黄，孙成文。细胞因子药理与临床[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997:156-160.[13]丁樱，冯斌，任献青，等。清心饮对实验性病毒性心肌炎小鼠细胞免疫功能的影响[J].中医研究，2005,18(12):13-15.[14]马勇，朱萱萱，赵智强，等。清心饮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用[J].南京中医药大学学报，2006,22(4):243-245.[15]黄熙，文爱东，夏天，等。中药药代动力学的研究方法[J].中国中药杂志，1997,22(11):643-648.[16]李仪奎。中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991:236-240.[17]陈学忠，黄熙，文爱东，等。中药血清药理学的方法学研究[J].中国中西医结合杂志，1999,19(2):113-115.[18]黄熙，臧益民，文爱东，等。中药复方药代动力学研究的思路与方法[J].中国中西医结合杂志，1997,17(10):634-636.[19]王本祥。现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997:1256-1260.[20]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