外泌体在乙型肝炎病毒感染进展及诊疗中的作用：机制与临床应用

外泌体在乙型肝炎病毒感染进展及诊疗中的作用：机制与临床应用【摘要】乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，每年约导致百万人死亡。外泌体是由脂质双层膜包裹的纳米级囊泡（30～150nm），几乎所有细胞都能分泌，携带蛋白质、核酸和脂质等活性物质，在细胞间信息传递中扮演关键角色。近年来研究结果显示，外泌体在HBV感染的疾病进展、诊断和治疗中发挥着重要作用。现系统综述外泌体在HBV感染中的双重角色（既促进病毒传播又参与免疫调控）、作为新型生物标志物在HBV相关肝病诊断中的应用、基于外泌体的治疗策略最新研究进展以及临床转化现状，以期为HBV感染的临床诊疗提供更新、更精准的生物学标志物和治疗靶点，对未来研究方向提出展望。【关键词】外泌体；乙型肝炎病毒；感染；诊疗；综述《2024年全球肝炎报告》显示，2022年全球共130万人死于病毒性肝炎，较2019年上升，其中83%死亡病例由乙型肝炎引起，乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染是全球健康挑战，其慢性化是肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）的主要原因；目前乙型肝炎诊疗情况并不理想［1-2］。因此，世界卫生组织呼吁寻找更新、更精准的生物学标志物和治疗靶点防控疾病。外泌体是一种直径为30～150nm的磷脂双分子膜结构的细胞囊泡，广泛存在于血液、尿液、脑脊液等多种体液中，近年研究发现，作为细胞间通讯的信使，外泌体可影响感染、炎症、肿瘤等多种疾病的生理病理过程［3-4］。研究表明，在病毒感染领域，外泌体既能促进病毒传播和免疫逃逸，又参与抗病毒应答影响治疗结局［5］。本文旨在全面综述外泌体在HBV感染进展及诊疗中的作用和临床转化的最新研究进展，为相关领域的研究提供参考。一、外泌体概述（一）外泌体的生物发生与特性外泌体的生成主要依赖于内体途径，并通过细胞内的“内吞-多泡体-外泌体”轴进行精密调控。在典型的生物发生过程中，形成多泡体（multivesicularbodies，MVB）需要内体分选复合物（endosomalsortingcomplexrequiredfortransport，ESCRT）机制，该机制通过将泛素化的细胞内货物分选并装载到内体囊泡（intraluminalvesicle，ILV）中，从而决定外泌体是否能够携带特定“货物”。ESCRT系统由4种主要亚基（ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）和辅助蛋白［如ALG-2相互作用蛋白X（ALG-2-interactingproteinX，Alix）］组成［6］。ESCRT-0首先捕获泛素化蛋白并锚定于早期内体膜上；随后，ESCRT-I和ESCRT-II协同作用，诱导膜局部向内弯曲形成芽状结构；接着，ESCRT-Ⅲ亚复合体［如带电荷多泡体蛋白4B（chargedmultivesicularbodyprotein4B，CHMP4B］聚集在芽颈内侧，构建高度弯曲的结构，随后三磷酸腺苷水解驱动ESCRT-III解聚并完成膜断裂，最终形成ILV。除了ESCRT依赖机制外，外泌体的形成也可通过ESCRT非依赖途径实现，该途径主要依赖于特定的脂质代谢酶，如中性鞘磷脂酶2介导的神经酰胺生成或磷脂酶D2介导的磷脂酸生成。最终，含ILV的晚期内体被称为MVB，细胞可选择将其与溶酶体融合进行降解，或沿微管运输至质膜准备分泌，部分ESCRT组件［Alix和肿瘤易感基因101（tumorsusceptibilitygene101，TSG101）］会随外泌体释放，成为外泌体的标志物［6-7］。HBV在复制和释放过程中，巧妙利用了与外泌体形成高度重叠的囊泡运输网络，可直接利用外泌体途径实现病毒跨细胞传递［8］。（二）外泌体的细胞间通信功能外泌体作为细胞外囊泡的重要亚型，能携带脂质、蛋白质、编码和非编码RNA以及线粒体DNA等多种生物大分子，且因磷脂双分子层结构保护分子不易被酶降解，使其成为稳定的信息载体，在细胞间通讯和基因表达中发挥关键作用［3-4］。据外泌体公共数据库ExoCarta统计，来自各种生物和细胞的外泌体含有119489种蛋白质、3946种脂质、4946种信使RNA（messengerRNA，mRNA）和10755种微小RNA（microRNA，miRNA或miR）［9］。这些分子组成不仅反映了来源细胞的特性，也决定了外泌体的功能多样性。Qian等［10］报道了血浆外泌体中含有染色体外环状DNA，其不仅在肝脏病理过程中发挥作用，还可调节其他器官功能，加速疾病恶化。此外，外泌体miRNA也多次被证实在细胞增殖分化、转移和化学治疗耐药性中作用显著［11］。在HBV感染中，外泌体携带的HBVDNA、RNA可以作为病毒传播的新途径，促进病毒在肝细胞间的扩散。其蛋白质成分同样多样且功能复杂，特异性蛋白与细胞来源和生理状态相关，例如CD151在HCC细胞外泌体中高表达且与不良生存有关［12］。而间充质干细胞衍生的外泌体（mesenchymalstemcell-derivedexosome，MSC-EXO）在治疗肝纤维化、肝衰竭、HCC等肝损伤中具有重要意义，并参与肝脏再生的过程［13］。因此，深入探究外泌体在疾病中的复杂作用机制，可为发掘新型诊疗策略开辟重要途径。二、外泌体在HBV感染中的双重作用随着研究推进，人们对HBV传播机制及人体免疫反应的认识不断深化，逐渐发现外泌体在HBV感染中作用关键且复杂，兼具促进病毒传播与参与免疫调节的双重功能。（一）外泌体在HBV传播中的作用外泌体可作为HBV的载体。如上所述，HBV的生命活动过程与外泌体形成过程存在一定相似性，且病毒颗粒的组装及释放高度依赖宿主ESCRT系统。Li等［8］发现自噬-晚期内体/MVB-外泌体轴调节着HBV复制和释放，外泌体可作为其释放平台，二者之间存在显著的调控关联。HBV通过劫持宿主的ESCRT组件——Alix和TSG101，结合病毒核心蛋白的脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-酪氨酸基序，促进裸壳体和完整病毒颗粒的装配及出芽。神经前体细胞发育下调蛋白4泛素化酶及CHMP4B协同参与膜动力学重塑，进一步完成病毒的组装与分泌。此外，HBV感染能够诱导内质网应激，进而促进病毒组分包装入外泌体，这不仅增强了病毒的感染性，还有效帮助其逃避免疫监视。相反，异常的ESCRT表达或外泌体生物发生受阻会扰乱HBV的装配与释放关键阶段。因此，抑制外泌体形成或干扰ESCRT通路已被证实能够阻断HBV的释放，进一步确立了外泌体与ESCRT系统是HBV生命周期的关键依赖路径［14-15］。由于外泌体与亲源细胞的关系十分密切，来自HBV感染肝细胞的外泌体中可以检测到包括HBVDNA、RNA及病毒蛋白，甚至完整病毒颗粒等多种HBV成分。Wu等［16］证明并可视化了外泌体中存在完整的传染性HBV颗粒，能靶向递送至肝细胞以达到有效感染，还能递送至非耐受性细胞，初步证实了HBV通过宿主细胞外泌体感染其他细胞的可能性。这一先前未被发现的将HBV颗粒包裹于外泌体的策略，可能是一种逃避免疫反应的方式：外泌体通过充当免疫系统与HBV颗粒之间的物理屏障使HBV颗粒在微环境中受到保护而无法降解，从而感染正常肝细胞和自然杀伤细胞，使HBV在体内持久存在，延长复制及感染时间［17］。此外，HBV修饰的外泌体不仅能促进HBV及其相关成分的释放，外泌体数目的增加也会提高HBV的传染性［15］。这均表明，外泌体或许是推动HBV传播的又一重要因素。（二）外泌体调节HBV感染相关免疫反应在免疫调节方面，外泌体具有促进和抑制感染的双向功能。其促进感染有两种方式，即通过传播病毒和受染细胞组分、诱导免疫逃逸或者抑制免疫反应来提高病毒感染性。在慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）患者，体内升高的免疫抑制调节性T细胞会抑制效应T细胞的功能，使得机体对HBV的免疫清除反应不充分，而这一现象极可能与病毒感染细胞来源的外泌体抑制免疫应答相关［18］。付琪备和寇国先［19］研究发现，HBV感染患者外周血外泌体miR-21、miR-20a的升高能够促进外周血骨髓源性抑制细胞（myeloid-derivedsuppressorcell，MDSC）增多，从而抑制T细胞功能，使机体免疫受抑制而难以有效清除HBV。另外，感染HBV肝细胞来源外泌体中多种免疫调节分子mRNA水平升高，当其被转移到巨噬细胞中，可抑制白细胞介素（interleukin，IL）-12p35mRNA的表达，对抗宿主先天性抗病毒免疫反应［20］。此外，来自HBV感染肝细胞的CD63+外泌体被鉴定含有可以负调节干扰素（interferon，IFN）-α信号传导的干扰素诱导跨膜蛋白2，从而阻断外源性IFN-α抗HBV功效，并且还可以被树突状细胞（dendriticcells，DC）摄取，进一步抑制内源性IFN-α的合成，另外HBV相关的外泌体还可通过抑制血清促炎因子IL-6的表达来抑制免疫［21］。相反，外泌体亦能发挥抗病毒效应，主要是通过诱导、递送抗病毒因子和阻碍病毒入侵来抵抗病毒感染。例如，T细胞衍生外泌体可以携带CD4中和病毒；抗原提呈细胞（antigen-presentingcells，APC）可以在抗原处理过程中将病毒表位引入外泌体内，使之更易被识别，从而激发获得性免疫；并且APC相关外泌体进入未感染细胞可限制病毒复制和传播［5］。HBV共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）是HBV建立持续性感染、难以根治的“元凶”。cccDNA以“微染色体”形式被组蛋白包装，在肝细胞核内复制，可转录所有病毒RNA，包括前基因组核糖核酸（pre-genomicRNA，pgRNA）和各亚基因组RNA，从而支持完整病毒生命周期。依靠残留的cccDNA，HBV能够随时重启复制。现有治疗虽能有效抑制病毒复制，但无法清除cccDNA，使得完全根除HBV变得困难，患者大多需要终身治疗且疗效欠佳［22］。而IFN-α介导的抗病毒反应对于清除HBV有重要意义，它能够通过Janus激酶-信号转导及转录激活因子（JAK-STAT）通路引导各种干扰素刺激基因（interferon-stimulatedgene，ISG）降解pgRNA、抑制cccDNA转录、阻断病毒装配［2］。外泌体也参与这些过程。研究发现，在HBV感染过程中，巨噬细胞在受到IFN-α刺激后会分泌并释放含有特定miRNA（包括hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-25-5p、hsa-miR-574-5p和miR-106b-3p等）的外泌体，并通过与HBV感染的肝细胞融合或内吞等方式，将携带的miRNA传递至感染细胞内，靶向HBV的基因组或相关调控分子，进而通过调控多梳蛋白家族环指基因3-磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PCGF3/PI3K/AKT）信号轴来上调ISG、降低pgRNA与聚合酶mRNA水平、减少cccDNA转录与复制，从而发挥保护作用［17，23-24］。研究结果显示，在IFN的刺激下，肝非实质细胞能够通过释放外泌体，将一种发挥直接抗病毒效应的ISG分子——载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G递送至被感染的肝实质细胞，恢复肝实质细胞的抗病毒能力［25］。HBV感染的肝细胞也会表达特定的外泌体miRNA如HBV-miR-3，下调肝细胞中的细胞因子信号抑制因子5，协同ISG以增强IFN诱导的抗病毒效应［26］。三、外泌体与HBV感染后的诊疗外泌体在HBV感染中兼具“帮凶”与“助手”双重角色，其复杂功能为理解HBV致病机制及开发新型防治策略提供了重要视角。多年来，我国通过接种疫苗在降低新生儿HBV感染率上付出了巨大努力，但低诊断和治疗率仍是消除病毒性肝炎公共卫生危害目标的最大障碍，大规模的有效筛查和治疗是降低相关病死率的关键［27］。外泌体携带的病毒成分，不仅可以调节免疫应答，因其特异性还能作为疾病早期诊断及预后评估的重要分子。且与其他载体相比具有低免疫原性、高物理化学稳定性、生物相容性和低毒性等多种生物学优势，工程化外泌体可作为新一代无细胞疫苗、RNA疗法及药物治疗载体，为疾病治疗开辟新的可能［28-29］。（一）外泌体对HBV感染的诊断价值外泌体正掀起“液态活检”领域的革命。肝活组织检查（肝活检）的侵袭性和高成本使其临床应用受限，外泌体能够稳定地反映疾病状态，在临床诊断领域潜力巨大，尤其对血清HBVDNA阴性的患者。Xu等［30］研究发现，CHB患者血清HBVDNA阴性时也可检测到外泌体HBVDNA，且与胆红素指标强烈正相关。因此在高度怀疑HBV感染但血清HBVDNA阴性的患者中，外泌体HBVDNA可以作为一个敏感且稳定的诊断新指标，并且能在一定程度上反映肝损伤和用于监测治疗效果。Ye等［31］发现，CHB患者的血浆外泌体中特征性蛋白质谱，如补体成分9（complementcomponent9，C9）、脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-bindingprotein，LBP）、含五聚蛋白结构域的蛋白1（pentraxindomain-containingprotein1，SVEP1）和血管性血友病因子（vonwillebrandfactor，VWF）的水平均高于健康者，受试者操作特征曲线下面积（areaundercurve，AUC）分别为0.925、0.950、0.900和0.875。此外，外泌体携带的特定RNA分子也具有诊断价值。Gan等［32］发现，HBV-miR-3仅存在于CHB患者的外周血外泌体中，并且与HBVDNA、HBV前基因组和HBsAg呈正相关，能动态反映抗病毒治疗效果。miR-21［19］、miR-20a［19］、miR-222［33］等均在HBV感染的肝细胞外泌体中被发现增加。HBV的持续感染可致肝纤维化、肝硬化，最终可能癌变。在肝纤维化诊断中，王巍等［34］发现血清外泌体核富集转录本1（LncRNANEAT1）诊断不同程度肝纤维化的敏感度与特异度均超过70%。肝硬化诊断方面，尹博阳等［35］发现血清外泌体miR-214水平和HBVDNA载量升高，总肝体积/脾脏体积与miR-214联合诊断的AUC达0.920。对于HBV相关性HCC，叶开等［36］发现血浆外泌体表面活性剂相关1假基因（LncRNASFTA1P）和miR-483-3p异常表达，联合诊断AUC为0.957，敏感度和特异度分别为94.80%、82.00%。此外，Hu等［11］确定了一组独特的血浆外泌体miRNA（miR-212-5p、miR-1248和miR-1250-5p）作为诊断生物标志物，并且设计构建的miRAGe（miRNA+甲胎蛋白+性别）诊断模型成功实现了89.00%的灵敏度和94.68%的特异度，展现出在临床诊断HCC的巨大潜力。因此，患者外泌体中HBVDNA、蛋白质、miRNA、LncRNA等均可作为HBV相关肝病诊断标志物的补充，且多类型外泌体标志物联合检测进一步优化了早期诊断精准度。（二）外泌体在HBV治疗中的潜力与挑战科学家正在开发"武装外泌体"技术，通过基因工程改造外泌体用于靶向治疗。当前药物无法完全根除病毒主要是因为病毒感染早期CD4+T细胞启动效率低及后续出现无效CD8+T细胞反应［37］。而研究表明，DC衍生的外泌体（DC-derivedexosome，Dex）表达肿瘤抗原、主要组织相容性抗原及其表面共刺激分子，能直接刺激抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，工程化改造后有望成为免疫调节的有效递送系统［38］。基于此，Lv等［39］证实了负载TAP结合蛋白的Dex（Dexsloadingtapasin，TPN-Dex）可通过上调CD8+T细胞自噬来增强T细胞免疫应答，并抑制病毒复制。Yang等［40］发现，装载泛素化HBV核心抗原的Dex（DexsloadedwithubiquitinatedHBVcoreantigen，Dexs-Ub-HBcAg）能有效刺激T细胞增殖，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞活化，引发免疫反应。这些研究结果共同表明，以Dex为基础构建的、包含特定抗原成分的载体系统，有潜力作为一种新型免疫载体疫苗疗法用于清除HBV。此外，APC来源的外泌体可以同时递送病毒抗原和免疫刺激分子，以激活特异性T细胞免疫应答［41］，一方面增强细胞、体液双重免疫应答，另一方面调节了免疫抑制微环境，为HBV治疗性疫苗的开发提供了有潜力的新途径。除了增强免疫反应来抗病毒，研究还发现包括泛硫乙胺、丙咪嗪和GW4869在内的靶向脂质代谢和外泌体生成的抑制剂能够通过直接抑制外泌体分泌和间接干扰病毒囊泡运输来显著减少HBV的释放，达到治疗目的［8］。而MSC-EXO在治疗领域也发挥着重要作用。它能够增强肝星状细胞铁死亡，减少肝损伤，MSC-EXO中所含的miR-181-5p可通过直接靶向Bcl-2和Stat3抑制肝星状细胞活化，进而减少肝纤维化的发生，同时miR-125b可通过抑制Hh信号转导来减少肝纤维化并促进肝细胞再生［13］。还有研究进一步将可注射水凝胶作为“药物仓库”与工程化MSC-EXO结合，构建“水凝胶+工程化MSC-EXO”靶向治疗策略，解决了外泌体在体内半衰期短、靶向性差的难题，为慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化治疗提供新思路［42］。另外，基因编辑技术在CHB治疗中的应用展现出巨大潜力。研究表明，表面镶嵌水泡性口炎病毒糖蛋白的工程化外泌体能高效递送成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（9CRISPR-Cas9）基因剪刀，直接靶向切割cccDNA，抑制病毒复制和功能蛋白表达，为HBV感染的功能性治愈提供了希望［43］。进一步地，SP94和CD47双修饰的外泌体可以高效靶向HCC递送治疗性核酸Polo样激酶（1Polo-likekinase1，PLK1）小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），有效抑制肿瘤生长，为HCC的靶向治疗提供了新的策略［44］。以上基于外泌体的治疗策略已有多项得到临床前研究的验证，展示出了巨大潜力。例如，免疫调节增强法（如负载Tapasin［39］）、双策略协同外泌体疫苗（抗原+免疫刺激［41］）、基因编辑递送法（如Cas9/gRNA［43］）。这些创新疗法或许终将攻克乙型肝炎治愈难题。（三）外泌体在HBV诊疗中的临床转化现状外泌体作为HBV诊疗工具，目前仍在机制探索和临床前概念验证层面等早期阶段，临床转化面临标准化、验证与安全评估等多重挑战。分离与表征缺乏统一标准是首要瓶颈。当前主流分离方法均需在纯度与得率间权衡，且缺乏统一的质控指标：差速/超速离心操作简便、通量高，但易损伤囊泡并引入蛋白污染；密度梯度离心纯度高，但耗时久且设备要求严苛；尺寸排阻色谱能有效去除小分子污染却易造成外泌体稀释与样品损失。尤其在血液中与脂蛋白等污染物难以区分，导致高特异性分离困难［45-47］。必须遵循MISEV2023等国际最新指南，结合透射电镜、纳米颗粒追踪分析或纳米流式，以及蛋白质标志物检测或质谱分析进行多技术联合表征，以确保批次间一致性与结果的可靠性［45］。诊断应用面临灵敏度与验证双重难题。外泌体具有高度异质性，其物理特性及分子载荷的差异直接影响检测结果的重复性。疾病相关外泌体（如肿瘤细胞来源）在血液中占比极低（<0.1%），且标志物表达存在个体差异，对检测技术的灵敏度与特异性构成挑战［48］。此外，现有生物标志物研究多基于小样本队列，不同检测平台差异大，缺乏多中心、大规模临床验证和标准化分析验证流程［49］。治疗应用聚焦于工程化外泌体，但其开发存在障碍。实现精准治疗主要依靠表面修饰和生物活性装载，如融合肝靶向肽、连接核酸适体等可提升靶向性，但修饰效率、载药稳定性及符合药品生产质量管理规范的规模化生产质量控制仍是难题［50-52］。而且工程化改造可能引入新抗原，必须进行更为谨慎系统的临床前安全性评估，包括免疫原性、器官分布及潜在毒性研究［53］。综上所述，外泌体在HBV诊疗中的临床转化，亟须在国际指南框架下推动全链条技术标准化、诊断分析的严谨验证以及治疗产品的规范开发与安全评估等临床试验验证。四、未来展望外泌体在HBV感染中具双重角色（图1）：既是病毒的"帮凶"，促进病毒传播和免疫逃逸；又是免疫系统的"盟友"，参与抗病毒应答和免疫调节影响感染结局，成为研究的重点和热点［5］。诊断上，外泌体可作为稳定性高、特异性好的“液态活检”标志物［17，30］，特别是在血清HBVDNA阴性的患者中仍能检测到外泌体HBVDNA［30］。另外，其携带的特定miRNA、lncRNA和蛋白质等分子，也可作为评估疾病进展和治疗反应的生物标志物［11，31，36（］图1，表1）。同时，基于外泌体的治疗策略如外泌体疫苗［41］、工程化外泌体递送CRISPR-Cas9系统［43］等，为HBV治疗提供了新思路（图1）。尤其是针对难以清除的cccDNA，外泌体递送基因编辑工具或成突破当前治疗瓶颈的关键［43］。来研究值得关注的方向：一是进一步阐明外泌体在HBV感染中的精确分子机制。虽已知其携带病毒成分和宿主因子，但如何精确调控病毒复制和宿主免疫应答仍需深入研究。二是建立标准化外泌体分离、鉴定和定量方法以解决当前研究异质性问题及更好推进临床诊断标志物的开发［29］。三是探索外泌体作为药物递送系统的潜力，开发基于外泌体的抗病毒药物递送系统，提高现有药物疗效和安全性。外泌体研究虽面临参与HBV感染分子机制不明、生物标志物应用标准缺失等系列技术挑战，但分离技术正不断突破［54］。并且随着单囊泡分析、人工智能等新技术的应用，外泌体在诊断和抗病毒治疗中的临床转化前景可期［29］。从精准诊断到靶向治疗，目标将外泌体生物标志物纳入HBV常规检测，同时推进新型免疫治疗策略的临床应用，优化制备工艺，评估疗效与安全性，这场由纳米级囊泡引领的医学革命，或许就是终结乙型肝炎大流行的关键密钥。参考文献1WorldHealthOrganization.Globalhepatitisreport2024:actionforaccessinlow-andmiddle-incomecountries[R].2024./health-topics/hepatitis.2LeiZ,WangL,GaoH,etal.MechanismsunderlyingthecompromisedclinicalefficacyofinterferoninclearingHBV[J].VirolJ,2024,21(1):314.DOI:10.1186/s12985-024-02589-3.3HushmandiK,SaadatSH,RaeiM,etal.Thescienceofexosomes:understandingtheirformation,capture,androleincellularcommunication[J].PatholResPract,2024,259:155388.DOI:10.1016/j.prp.2024.155388.4PengY,YangY,LiY,etal.Exosomeandvirusinfection[J].FrontImmunol,2023,14:1154217.DOI:10.3389/fimmu.2023.1154217.5MardiN,HaiatyS,RahbarghaziR,etal.Exosomaltransmissionofviruses,atwo-edgedbiologicalsword[J].CellCommunSignal,2023,21(1):19.DOI:10.1186/s12964-022-01037-5.6ZhouX,XieF,WangL,etal.Thefunctionandclinicalapplicationofextracellularvesiclesininnateimmuneregulation[J].CellMolImmunol,2020,17(4):323-334.DOI:10.1038/s41423-020-0391-1.7AryaSB,CollieSP,P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