T-CVMA 280-2025 山羊痘和绵羊痘病毒通.用型荧光PCR检测方法

CCSB41T/CVMA280—2025山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法DetectionmethodofuniversalfluorescentPCRforgoatpoxvirusandsheeppoxvirus2025-8-13发布中国兽医协会发布IT/CVMA280—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由中国海关科学技术研究中心提出。本标准由中国兽医协会归口。本标准起草单位：中国海关科学技术研究中心、沈阳海关技术中心、河南国际旅行卫生保健中心和大连旅顺文化旅游集团有限公司。本标准主要起草人：耿庆华、史喜菊、徐超、刘学森、啜微微、李成镛。T/CVMA280—20251山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法本文件规定山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法。本文件适用于山羊痘和绵羊痘病毒的检测及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T3186羊冷冻精液生产技术规程3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（Fluorescentpolymerasechainreaction）Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）GPTV：山羊痘病毒（Goatpoxvirus）SPPV：绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus）5仪器与设备5.1荧光PCR检测仪。5.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。5.3生物安全柜。5.4组织研磨器。5.5普通冰箱。5.6超低温冰箱：可控温至-70℃。T/CVMA280—20255.7可调单道移液器（0.2μL~2μL、1μL~5.8高压灭菌锅。6试剂和耗材6.1试剂6.1.1商品化DNA抽提试剂盒，于4℃~8℃保存。6.1.2无水乙醇，-20℃预冷。6.1.375%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。6.1.48mMNaOH溶液，配制见附录A。6.1.5PBS缓冲液，0.01mol/LPBS，pH7.4，配制见附录A。6.1.62×Real-timePCR预混液，-20℃保存，或按照商品化试剂说明书要求保存。6.1.71.5mL离心管。6.1.80.2mLPCR薄壁管或八联管。6.2阳性对照山羊痘和绵羊痘病毒阳性对照样品：采用商品化山羊痘或绵羊痘病毒疫苗或接种了山羊痘和绵羊痘病毒的细胞悬液或者含有山羊痘和绵羊痘病毒目的基因的核酸（阳性对照核酸序列见附录B）。6.3阴性对照山羊痘和绵羊痘病毒阴性对照样品：采用绵羊羔睾丸细胞悬液或健康羊肉组织。6.4引物和探针序列引物和TaqMan探针序列见附录C。7样品采集和处理7.1采样工具手术刀、剪刀、镊子，研钵等，经160℃干热灭菌2h。一次性无菌采样拭子，真空采血管，记号笔，低温保藏箱。7.2样品采集7.2.1血清样本采集：用无菌注射器抽取受检山羊或绵羊静脉血不少于5mL，置于无菌离心管内，室温或者37℃倾斜放置自然凝集20min~30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液200μL到新的离心管内备用。7.2.2精液样品采集：按照NY/T3186的方法采集和保存精液。T/CVMA280—20257.2.3鼻拭子采集：用棉拭子取受检山羊或绵羊鼻腔分泌物，置于2mLPBS缓冲液中备用。37.2.4组织样本采集：取活体或剖检羊的皮肤丘疹置于PBS缓冲液中备用。7.2.5细胞培养物：待出现80%以上细胞病变时，将整瓶细胞冻在-80℃备用。7.3样品送检上述采集的样本可立即用于检测，样本在2℃~8℃下保存应不超过24h，-20℃±0.5℃可以稳定保存3个月，长期保存请置于-70℃以下。样本运送采用低温保藏箱或泡沫箱加生物冰袋密封进行运输，并符合NY/T541和《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》的相关要求。7.4样品处理7.4.1血清和精液样本无需进行前处理，直接用于核酸提取。7.4.2鼻拭子样本：充分涡旋震荡含有鼻拭子的管子1min~3min，2000r/min离心5min，取出200μL上清，用于后续的核酸提取。7.4.3组织样本：取1g解冻的组织，剪碎，加入2mLPBS缓冲液进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min，取上清200μL，用于后续的核酸提取。7.4.4细胞培养物：将细胞培养物反复冻融3次，解冻期间，间隔5min，摇晃十次细胞培养瓶，第3次解冻后，将细胞培养物置于灭菌离心管内，4000r/min，4℃离心10min，取上清200μL，用于后续的核酸提取。8操作方法8.1实验室要求开展山羊痘和绵羊痘病毒荧光PCR检测的实验室应分为三个相对独立的工作区域：核酸提取区、试剂配制区和检测区。工作区域间应有明确的标识，每一个区域应有专用的仪器设备，避免不同区域的设备、物品共用。8.2DNA提取8.2.1DNA提取使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒提取，在核酸提取区操作。8.2.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数、阳性对照数和阴性对照数之和，对每个离心管进行编号。8.2.3每管加入800μLDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混匀，4℃或室温10000r/min离心10min。8.2.4取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min；4℃或室温10000r/min离心5min。8.2.5弃上清，沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇，颠倒3~6次混匀，4℃10000r/min离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。T/CVMA280—20258.2.6用30μL的8mMNaOH溶液溶解沉淀，DNA在4℃冰箱可稳定保存数月，-20℃冰箱可长期保存。8.3荧光PCR检测8.3.1反应体系的配制在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n，n为待检样品数、阳性对照数和阴性对照数之和，每个反应的体系见附录D.1，为了避免移液器取样损失，建议按n+1个反应进行配制。配制反应液在冰盒中进行。8.3.2反应液的分装将8.3.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管20μL分装于0.2mLPCR管内，将PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。8.3.3加样在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加入8.2制备的5μLDNA核酸溶液，盖上盖子，500r/min~1000r/min离心30s。转移至检测区。8.3.4上机检测在检测区进行。将7.3.3中离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，设置探针：59选择FAM荧光通道，39选择MGB荧光通道。8.3.5荧光PCR反应程序：荧光PCR反应程序见附录D中D.2。9结果判定9.1试验成立条件9.1.1阴性对照：无Ct值或无典型的S型扩增曲线；9.1.2阳性对照：Ct值≤35，且扩增曲线为典型的S型；9.1.3以上要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。9.2结果描述及判定9.2.1被检样品检测结果中Ct值≤40，且有典型的S形扩增曲线，判定为GPTV或SPPV阳性；9.2.2被检样品检测结果无Ct值或无典型的S型扩增曲线，判定为GPTV或SPPV阴性。9.2.3被检样品检测结果中40＜Ct值＜45，且有扩增曲线，判定为GPTV或SPPV疑似；需要进行重复试验。9.2.4对GPTV/SPPV可疑样品，使用原始备份样本重新提取核酸，进行两次独立重复检测，若任意一次检测结果满足9.2.1，则判定为阳性；若所有检测结果均为阴性或可疑，则判定阴性。T/CVMA280—202510实验室生物安全要求5实验室生物安全要求应符合GB19489的相关要求。T/CVMA280—2025相关试剂的配置A.18mMNaOH溶液称量0.32gNaOH，溶解到1000mL去离子水中（或按照此浓度配置适合体积的NaOH溶液混匀，分装，常温保存。A.2磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS,pH7.4）用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后经121℃、15min高压灭菌后备用。7T/CVMA280—2025阳性对照参考基因序列B.1山羊痘和绵羊痘阳性对照参考基因序列（GenBankAccessionNo.PQ360994）5'-ATGTGTTATCATCTTCTATAACAACAATAAACTTATTCTCAGAATTTTTTATATCCGCATCGGCATACGATTTCCATAAACTAAAGTGTTTTGCAATAGAACTTTTTGCCTCTTTTGTACAAAGAGCATTACATAATCCAGAAAAATATTCTGTAAAATTTTCAACACCTCCTGATTTTTCTACCTTTTCCCATATAAGTAACTTATATGATAAACTGATATCATCTTTTTTATCTTTTAAAAAAAAATTTACATCTGAATTTTTAAAATCTTTTACTGTGTCAACTTTTTTATAAAATATATCATTGTCACTTTTTAA-3'8T/CVMA280—2025引物和探针序列引物、探针的名称与序列见表B.1。表B