禽疫病诊断技术 第2部分：鸡星状病毒-地方标准编制说明

一、工作简况（一）任务来源2023年8月，山东省市场监督管理局下发了《关于印发2023年度标准化创新发展计划项目的通知》（鲁市监标函〔2023〕246号），下达了《禽疫病诊断技术第2部分：鸡星状病毒》山东省地方标准的制定任务。由青岛农业大学牵头起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。（二）起草单位、起草人及任务分工起草单位：青岛农业大学、青岛市畜牧工作站（青岛市畜牧兽医研究所）、高密市畜牧兽医技术中心。起草人：王建琳、郝小静、尹燕博、潘青、王永海、侯冉冉、刘锡武、张灿、衣服德、徐守振、刘爱晶、李方正、张倩、刘开东。任务分工：王建琳（青岛农业大学）为标准制定负责人，组织标准制定起草工作，组织协调制定标准，负责标准制定技术，试验及验证，报批材料等；尹燕博（青岛农业大学）负责标准制定技术方向；郝小静、刘锡武、衣服德、张倩、刘开东（青岛市畜牧工作站）、王永海（高密市畜牧兽医技术中心）负责临床样本的采集等；潘青、侯冉冉、张灿、徐守振、刘爱晶、李方正（青岛农业大学）负责整理鸡星状病毒RT-PCR方法和多重RT-PCR方法的相关资料和信息及修改完成标准征求意见等工作。（三）主要工作过程1.预研阶段项目下达后，首先成立了标准起草技术专家小组，主要由青岛农业大学、青岛市畜牧工作站具有丰富经验的专家组成。技术专家小组的任务是对标准起草进行技术把关，研讨标准的框架，内容和技术方法。其次按照项目任务书的要根据技术专家小组研究确定的标准起草内容，组织相关技术领域的专家，成立标准起草编制工作组，编制工作组由技术专家小组的部分成员和相关检测技术负责人组成，按要求和制定的方案开展标准起草工作。2.标准研究起草阶段标准起草编制工作组制定了工作计划，明确了人员分工及工作进度，启动了标准编制工作。工作人员查阅研究了大量的技术资料，这些技术资料主要有三类1）国内相关技术标准、规范、法律、法规等，包括国家标准1项，GB/T45093-2024《水禽新型星状病毒病诊断技术》；现行鹅星状病毒相关地方标准4项，DB36/T1747-2023《新型鹅星状病毒病诊断技术规程》，DB3212/T2035-2022《鹅星状病毒病综合防控技术规范》，DB37/T4459-2021《鹅星状病毒感染诊断技术规范》，DB34/T3401-2019《鹅星状病毒病防控技术规程》；现行星状病毒的国境口岸、出口检测行业标准4项，SN/T5108-2019《国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法》，SN/T3953-2014《国境口岸轮状病毒（A组）、诺如病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法》，SN/T3841-2014《出口贝类中诺如病毒和星状病毒的快速检测反转录-环介导恒温核酸扩增（RT-LAMP）法》，SN/T2519-2010《贝类中星状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》。（2）诊断技术研发资料，如星状病毒感染的临床诊断、病毒RT-PCR等相关技术研发进展的文《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求等。工作人员对上述资料进行了认真细致地研究，于2023年9月形成了《禽疫病诊断技术第2部分：鸡星状病毒》的初3.征求意见阶段起草小组于2023年10月至12月，将征求意见稿寄26家单位34位专家，征求意见单位包括进行家禽病毒病诊断技术研如中国海关科学技术研究中心、中国动物卫生与流行病学等；16个事业单位和企业：如莱西市农业农村局、乳山市动物疫病预防控制中心、青岛市华测检测技术有限公司、青岛动保国家工程技术研究中心有限公司等（详见征求意见汇总表）。有32位专家提出具体的修改意见，共征集到意见105条，其中采纳90条，占86%，部分采纳15条，占14%，对未采纳的意见都一一向专家做出解答和说明，并得到专家的认可。同时，三个单位对标准案中涉及的病毒RT-PCR和多重RT-PCR方法进行技术验证。起草小组结合采纳的征求意见和GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草标准》对征求意见稿进行了相应的修改和完善，形成供审查用送审稿。4.送审阶段2024年5月起草小组提交送审稿，并根据市场监督管理局专家意见进行标准中引言的补充、以及编制说明中相关内容的修改等。5.技术审查会阶段2025年6月19日接到山东省畜牧兽医局通知，开始准备技术审查会材料。2025年7月9日，山东省畜牧兽医局在青岛组织召开了标准审查会。9位专家听取标准编制情况汇报，对标准文本进行了逐章、逐条审查；最终经9位专家签字表决，全票通过审查。进行的技术审查会会议过程中，标准技术审查委员会根据山东省市场监督管理局下发的《关于山东省地方标准起草中开展公平竞争审查的通知》（鲁市监标函〔2025〕93号对该地方标准起草开展了公平竞争审查工作，并填写附件《山东省地方标准公平竞争审查表》，审查结论为本文件不包含排除、限制竞争效果的内容。6.修改及报批阶段的意见反复详细修改、仔细核对并形成报批材料上报。二、地方标准制定目的和意义鸡星状病毒（chickenastrovirus,CAstV）感染可引起鸡生长发育迟缓、腹泻性肠炎、肾炎等，导致生产力降低。CAstV感染于20世纪90年代首次发现，CAstV既可经卵垂直传播，也可通过粪口途径水平传播，各个年龄段的鸡均可感染，雏鸡感染后出现生长发育迟滞（runting-stuntingsyndrome，RSS)，白鸡综合征（whitechicksyndrome，WCS)和内脏痛风；种鸡感染导致鸡胚孵化率降低，给养鸡业造成了严重的经济损失。CAstV感染在世界各地均有发生，通常与其他肠道病毒年从江苏省某鸡场的肠道样本中检测到CAstV病毒基因，份样品进行CAstV的RT-PCR检测，结果表明综合阳性率为65.64%；采集的154份雏鸡肠道样品中127份阳性，其阳性率为82.46%。2022年对临床分离的CAstV毒株进行分子生物学特性研究，发现存在3个亚型CAstV，且均可明显导致雏鸡生长发育迟缓、孵化率降低、肝脏和肾脏严重损伤。以上研究结果表明，CAstV感染已严重影响了我国养鸡业的健康发展。山东省是我国家禽养殖大省，肉鸡出栏量连续多年位居全国第一。2017-2018年间对山东部分养殖场采集1日龄雏鸡盲肠样品40份，其中33份样品为CAstV阳性，阳性率为82.5%；2022年研究报道对临床8个省份家禽批发市场、养殖场和屠宰场等场点采集的家禽咽拭子和泄殖腔拭子进行CAstV检测，结果发现山东省阳性检测率最高，为10%，其年随机采集山东省5个蛋鸡场的143份泄殖腔拭子样品进行CAstV检测，其CAstV总阳性率为37.1%。以上临床样品检测结果表明，山东省CAstV感染严重，整个家禽产业链中均存在CAstV污染。鉴于CAstV感染在我国及山东省的广泛存在，该病无商业化疫苗可用于临床疫病防控，导致CAstV感染难以控制和在短期内根除。尽管临床无CAstV感染直接导致鸡只死亡的报道，但其造成孵化率的降低和雏鸡的生长发育迟缓给养鸡业造成了巨大经济损失。因此，建立CAstV感染的诊断方法和CAstV的检测方法，为该病的预防、治疗和净化提供必要的前提和有力的支撑，是目前养鸡业面临的十分必要和迫切解决的问题；建立该病诊断技术标准，开展早期诊断，以提高养殖场对该病的防控能力，促进绿色发展，提高养殖效益具有重要的意义。本标准根据CAstV感染的相关文献资料、结合团队的研究结果，提出CAstV感染的临床诊断、病毒RT-PCR和病毒多重RT-PCR的技术要求，利于临床CAstV感染诊断工作的开展，促进我省养鸡业的持续健康发展。三、标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准的编制原则本标准编制遵循“科学性、统一性、实用性、先进性”的原则，注重标准的通用性和可操作性，同时符合我国国情。1.科学性原则本标准编制以科学理论为基础，根据CAstV感染不同种类鸡群的流行特征、临床症状、病理变化等进行临床诊断；根据CAstV的基因组特征设计RT-PCR检测引物，进行CAstV特异性检测；根据临床可引起鸡痛风的三种病毒，建立相应的三重RT-PCR方法进行病毒检测。标准编制中的各项指标和技术要求都有充分的理论支持；且主要病理特征都进行相应的动物感染试验的验证、主要检测方法都进行多次的重复和多个单位的验证，确保所有诊断方法可靠、准确。2.统一性原则按照“制修订的标准应与国家现行的法律法规保持相对的高度协调性”的原则，在本标准制定过程中，与国家现行的法律法规，如《中华人民共和国畜牧法》、《中华人民共和国动物防疫法》保持了高度的一致。且标准编制格式符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。3.实用性原则按照“制定修订的标准应适用于行业的发展和生产实际，标准具有广泛的参考性和实用性”的基本原则，在本标准制定过程中，充分调查并广泛征求了高校、科研院所等专家的意见；征求了畜牧兽医工作站、检测结构及养殖场实验室检测人员的意见，在综合分析和讨论征求意见的基础上，进行修改和完善，因此，该技术标准具有很强的实用性和可操作性。4.先进性原则本标准制定过程中，充分吸收了国内外发表的CAstV感染诊断的相关研究报道，并结合临床近年来新分离毒株的致病特点，确保疾病临床诊断和病理特征具有准确性和代表性；采用实验室RT-PCR方法进行CAstV检测，以提高CAstV感染诊断的准确率；并结合当前实验室诊断的条件，达到科学性与实用性的有机统一，以确保本标准的适度先进性。（二）主要技术内容和确定依据主要技术内容包括CAstV感染的临床诊断、病毒RT-PCR和病毒多重RT-PCR技术。1.临床诊断1.1流行病学主要通过粪-口途径水平传播感染雏鸡，也可垂直传播；CAstV主要感染肉鸡，尤其是2～4周龄肉鸡，也在蛋鸡群中广泛传播。该部分内容参考文献（武宗仪，孔正茹，秦爱建，等.鸡星状病毒研究进展[J].中国家禽，2018，40(8):43-46;SmythVJ.AReviewoftheStrainDiversityandPathogenesisofChickenAstrovirus[J].Viruses.2017,9(2):29）完成。1.2临床症状患鸡主要表现羽毛蓬乱、苍白，精神沉郁，站立不稳，排稀便，出现群体生长不均衡或生长发育迟滞综合征。该部分内容参考文献（KangKI,El-GazzarM,SellersHS,etal.Investigationintotheaetiologyofruntingandstuntingsyndromeinchickens[J].AvianPathol,2012,Chickenastrovirusdetectedinhatchabilityproblemsassociatedwith“WhiteChicks”.VetRec,2013,173:403–404;SmythVJ.AReviewoftheStrainDivandPathogenesisofChickenAstrovirus[J].Viruses.2017,9(2):29）完成，并通过分离毒株感染SPF鸡胚进行验证，其结果见图1。鸡；右侧为对照鸡）。1.3病理变化1.3.1剖检病变主要表现为肠道肿胀，肠黏膜覆盖大量黏液；该部分内容参照文献(CanelliE,CordioliP,BarbieriI,etal.Astrovirusesascausativeagentsofpoultryenteritis:Geneticcharacterizationandlongitudinalstudiesonfieldconditions[J].AvianDis,2012,56:173–182)完成。肝脏局灶性坏死；肾脏肿胀；输尿管增粗其内充满白色尿酸盐，严重者心脏、肝脏表面和肾脏有尿酸盐沉积；该部分内容参考文献(SmythJA,ConnorTJ,McNeillyF,etal.Studiesonthepathogenicityofenterovirus-likevirusesinchickens[J].AvianPathol.2007,36:119–126;BulbuleNR,MandakhalikarKD,KapgateSS,etal.RoleofchickenastrovirusasacausativeagentofgoutincommerciPathol,2013,42:464–473)完成，并通过分离毒株感染SPF鸡进行验证，其结果见图2。肝脏脂肪变性、出血、伴针尖坏死；3：肾，肾肿胀出血，输尿管可见白色尿酸盐）1.3.2组织学病变肠道绒毛长度明显缩短，隐窝扩张；该部分内容参照文献（KangKI,LinnemannE,IcardAH,etal.Chickenastrovirusasanaetiologicalagentofrunting-stuntingsyndromeinbroilerchickens[J].JGenVirol,2018,99:512–524）完成。胆管增生、胆汁淤积、肝细胞坏死；间质性肾炎，伴广泛的尿酸盐沉积，近曲小管上皮细MandakhalikarKD,KapgateSS,etal.RoleofchickenastrovirusasacausativeagentofgoutincommercialbroilersinIndia[J].AvianPathol,2013,42:464–473)完成。1.4临床诊断结果判定符合1.1流行病学特征，患鸡出现1.2临床症状和1.3病理变化，可判定为鸡星状病毒感染疑似病例，应进行实验室2.病毒RT-PCRCAstV的实验室检测首先是临床样品采集，病原学诊断的最佳样品是泄殖腔拭子、肠道和肝脏等样品；采集样品的保存和运输，凡是未特别描述的均参照NY/T541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》。CAstV的实验室检测目的在于确定临床样本中是否存在病毒的核酸，病毒核酸检测阳性，即可确诊为感染CAstV。本标准根据GenBank中提交的CAstV毒株NJ1701的RNA依赖的RNA聚合酶基因序列（MH791394.1）设计合成特异性-ATGATAGGCTCTTGCCAGTT-3’；下游引物：5’-AGCAGCGGCATACTCCTC-3’；扩增产物为362bp的目标片段。样品中RNA的提取可采用Trizol法，也可采用商品化RT-PCR一步法试剂盒提取病毒RNA。按照表1配置RT-PCR一步法反应体系（不同公司生产的一步法RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修正使用）。通过试验确定反应程序为：50℃30min；95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。表1RT-PCR一步法反应体系体积(μL）无RNA酶水10×OnestepRNAPCRBuffer5MgCl2（25mmol/L）dNTPMixture（各10mmol/L）5上游引物（20μmol/mL）1下游引物（20μmol/mL）1RNaseInhibitor（40U/μL）1AMVRTaseXL（5U/μL）1AMV-OptimizedTaq（5U/μL）1模板RNA2扩增结果通过1%琼脂糖凝胶电泳进行观察，临床分离毒株样品在360bp左右出现扩增条带，其阴性对照无条带出现（图3）；该扩增结果进行测序，其测序结果如下：ATGATAGGCTCTTGCCAGTTTCAAGAGATTTTGTTATCTATGAGCCTGATACCATAGTAGCAATGTATGCTGATGTGTTCGGCATGTGGGTGAAACCAGAGAATGTAAAAGTGAAGAACACTCTTAGCGGCCTCTCTTTCTGTGGCATGACGATCACAAAGAATGAACATGGTCGTTATGTCGGAATTCCGAATGTCAACAAAATCTTGTCTACTTTGAGGTCTCCTACAAAGCGCCTCCCTAATATCGAGGCACTCTGGGGTAAGTTAATATCATTGAGAATTCTGTGTGAAAATGCAGATCCCGACGTAAAGGACTACTTGGATAAGCAGATTAATTGCGTCGAGGAGTATGCCGCTGCT。（M:Marker2000;1:设计的CAstV引物扩增条带；2.阴性对照）故CAstVRT-PCR结果成立条件为：阳性对照品出现362bp扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带；CAstVRT-PCR结果判定标准为：待检样品扩增产物电泳出现362bp目标条带，判为RT-PCR扩增阳性，表明样品中存在CAstV核酸；待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为362bp，判为RT-PCR扩增阴性，表明样品中无CAstV核酸。3.病毒多重RT-PCRCAstV感染后出现的尿酸盐沉积，与临床鸡传染性支气管炎和禽肾炎病毒感染相似，难于区分(RajiAA,OmarAR.PathogenesisofChickenAstrovirusRelatedIllnesses[J].FrontVetSci,2022,10;9:899901)，本标准通过建立多重RT-PCR方法进行实验室鉴别诊断。根据酶基因序列（MH791394.1）、禽肾炎病毒全基因序列（HM029238）的ORF1b基因和鸡传染性支气管炎病毒毒株IBV/ID757/2021全基因序列（OQ716704.1）的N基因分别设-ATGATAGGCTCTTGCCAGTT-3’，下游引物：5’-AGCAGCGGCATACTCCTC-3’，目的片段362bp；禽肾炎病毒上游引物5’-AACCTCTTGACCTGAGAATAAC-3’，下游引物：5’-CCATACCTCTTTCGTGAACGCC-3’，目的片段796bp；鸡传染性支气管炎病毒上游引物5’-AAGCAGAGCCTTGTCCCG-3’，下游引物：5’-CATTTCCCTGGCGATAGAG-3，目的片段1575bp。参照文献(栾庆东,曹旭,尹燕博,等.鸡星状病毒、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志,2022,58(03):32-36+41.)，按照上述引物进行相应病毒的PCR扩增。样品中RNA的提取可采用Trizol法，也可采用商品化RT-PCR一步法试剂盒提取病毒RNA。按照表1配置RT-PCR一步法反应体系（不同公司生产的一步法RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修正使用）。PCR的步骤如下：第一阶段95℃5min；第二阶段30个循环，94℃30s，55℃（鸡传染性支气管炎病毒57℃,禽肾炎病毒50℃)30s，72℃1min30s；第三阶段72℃10min。扩增结果通过1%琼脂糖凝胶电泳进行观察，临床分离毒株样品分别在360bp左右、800bp左右和1580bp左右出现扩增条带，其阴性对照无条带出现（图4）；该扩增结果进行胶回收后测序，其测序结果在Genbank进行Blast,结果显示其序列分别与CAstV毒株RNA依赖的RNA聚合酶基因、禽肾炎病毒ORF1b基因和鸡传染性支气管炎病毒N基因的同源性为100%。（M:Marker2000;1.三种病毒检测结果；2.阴性对照）参照文献(栾庆东,曹旭,尹燕博,等.鸡星状病毒、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志,2022,58(03):32-36+41.)，将保存的CAstV、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒cDNA进行PCR扩增，通过胶回收，回收目的片段，然后将各个目的片段连接到pMD18-T载体上，转化后，挑取单克隆，通过PCR验证后阳性质粒送测序，测序正确的，提取质粒。在建立单项PCR反