鱼类病毒性疫病核酸检测非致死采样技术规范-地方标准编制说明

《鱼类病毒性疫病核酸检测非致死采样技术规范》地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源根据山东省市场监督管理局《关于印发2021年度“山东标准”建设项目计划的通知》（鲁市监标函〔2021〕261号），《鱼类病毒性重大疫病核酸诊断检测非致死采样技术规范》列入2021年山东省地方标准制修订计划，标准项目计划编号为：2021-T-107。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施，由山东省农业标准化技术委员会归口。（二）起草单位、起草人及任务分工1.主要起草单位山东省淡水渔业研究院、山东省渔业发展和资源养护总站、济宁市渔业发展和资源养护中心。2.主要起草人陈秀丽、倪乐海、徐涛、秦玉广、臧金梁、胡斌、闫家仁、董俊、赵厚钧、吴广州、杨凤香。3.任务分工山东省淡水渔业研究院主要负责标准的立项需求调研、标准编制进度把关、内容设计、协助征集相关方意见等事项等整体编制工作。山东省渔业发展和资源养护总站参与标准内容设计、标准起草、征求意见建议等工作；济宁市渔业发展和资源养护中心协助参加标准调查研究、标准起草、参与标准修改完善、征求意见的汇总、归纳和处理。陈秀丽担任标准起草组组长，全面组织、协调标准的编制工作。倪乐海、徐涛、秦玉广负责标准文献查阅、专家咨询、标准修改等工作；臧金梁、胡斌、闫家仁、董俊、赵厚钧参与标准内容设计、检测结果验证、标准起草、对标准技术内容进行把关；吴广州、杨凤香对各相关方的意见和建议进行归纳整理，组织召开标准编制研讨会议及会议材料整理（三）起草过程标准的起草工作共分为五个阶段：第一阶段是成立工作组和标准草稿编写阶段。标准编制小组接到任务后，首先成立标准起草工作组，讨论提出标准草稿提纲，并进行了任务分工。标准起草小组通过检索目前国内关于鱼类病毒性疫病的资料，特别是鱼类各种病毒性疫病的检测标准，进行了认真研究分析，完成已有标准、文献资料的收集、分析和整理。标准起草工作组经过内部多次讨论、修改，编写完成标准草稿。第二阶段是修改完善完成标准征求意见稿。根据农业行业标准《水生动物产地检疫采样技术规范》和国家标准《出入境动物检疫采样》有关要求，结合近年来所承担的国家级、省级水生动物疫病专项监测工作，面向省内水生动物疫病检测机构、企业、被采样单位对省内鱼类病毒性重大疫病采样工作进行调研，根据调研情况对标准草稿进行修改完善，形成了本标准的征求意见稿及编制说明。小组将本标准的征求意见稿向社会广泛征求意见，把标准征求意见稿及编制说明发给山东省内从事病害检测、科学研究、技术推广等领域的30位专家征求意见。收到回函的单位或专家29个，共收集到各类意见建议74条，详细内容见《征求意见汇总处理表》。收到各位专家的意见建议后，标准编制小组共同讨论研究了各位专家提出的每条意见建议，最终采纳意见建议68条，对标准征求意见稿进行了修改完善，形成标准的送审稿及其编制说明。第四阶段是标准审查及修改阶段。2024年9月14日，山东省农业标准化技术委员会渔业标准化分技术委员会在济南组织召开山东省地方标准专家审查会议，来自中国水产科学研究院质量与标准研究中心等单位共9名专家组成的审查委员会听取了标准编制情况汇报，对标准文本进行了逐章、逐条审查，对标准编制说明等进行了审查。共收到审查会专家修改意见建议25条，标准起草小组根据专家意见建议进行了修改，采纳意见建议25条，形成标准报批稿和编制说明。第五阶段为报批阶段。标准起草组按照审查会意见，形成报批材料，上报省市场监督管理局。二、地方标准制定目的和意义病毒性疫病是水产养殖业中危害最大的一类疫病，病毒性疫病具有发病急、传播速度快、治疗困难、死亡率高等特点，近年来病毒性疫病给广大水产养殖从业者造成了巨大的经济损失。鱼类的病毒性疫病至今没有理想的治疗方法，主要依靠预防来控制此类疫病的发生。目前预防鱼类病毒性疫病最有效的办法是免疫预防，我国已经有针对如草鱼出血病等病毒性疫病的疫苗。要做好鱼类病毒性疫病的防控，首先要能准确及时地诊断出鱼类所患疫病类型，不要误将病毒病诊断为细菌或其他疫病，否则容易延误治疗时机或加重病情。当前，国家和省水生动物疫病监测计划也主要针对病毒性疫病。做好病毒性疫病的检测，对于保障水产养殖业的健康发展十分重要。核酸检测技术具有灵敏性高、特异性强的优势，是当前各类重大病毒性疫病诊断与检测的首选方法。目前，水生动物疫病监测计划中鲤春病毒血症、鲤疱疹病毒病、鲤浮肿病等鱼类病毒性疫病的检测均采用核酸检测法，样品采集部位多为鳃组织、内脏（脑、肝、肾、脾）等组织。鱼类疫病检验常规采样需解剖切取心、脑、肝、脾、肾组织器官，取样后鱼类难以存活，为典型致死性采样。对于鱼类亲本或一些名贵鱼类，按照常规方法采样都会给养殖户造成较大的经济损失。因此，找出一种既不影响开展鱼类病毒性疫病检测采样，又能保障鱼类采样后继续存活的采样方法，成为水产养殖从业者和检测采样人员的一大现实需求。18088-2000）中，鱼类血液是检验标的物之一。血液检验是医学临床检验和兽医临床检验的重要手段，鱼类血液采集是鱼病防控人员的一项基础技能，制样快速简便、储运经济节约。针对以采集鱼类血液进行病毒疫病检测诊断方法的灵敏度和有效性问题，在内部试验验证的基础上，提交有关病毒病的组织和血清样品到有检测资质能力的单位进行了对比验证。经试验和对比验证，以血清为标的进行有关病毒疫病检测诊断的方法在鱼类病毒性疫病的诊断检测方面具有可另外，非致死性采样可以实现对多疫病鱼类（如鲤鱼在保证样本存活前提下，依据不同敏感季节、敏感水温，对同一标本实现连续、跟踪检测，可精准判定是复合感染，还是单纯感染；还可弥补传统致死性采样，只能通过受检鱼体，间接反映养殖鱼类健康及质量状况的不足；更为重要的是通过亲本连续非致死检验，真正将种苗检疫的受检主体由种苗，前出延伸至亲本，可从根本上保障并优化苗种质量。综上，制定《鱼类病毒性疫病核酸检测非致死采样技术规范》，对于做好名贵鱼类或亲本等特殊群体，和有特殊监测需求的疫病检测采样十分必要。通过该标准的制定和实施，将进一步规范和指导我省鱼类病毒性疫病监测的采样工作，进一步提高疫病监测质量效果，更好地服务于我省现代渔业绿色健康发展。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据；修订标准时，还包括修订前后技术内容的对比（一）标准编制原则1.规范性原则本标准按照GB/T1.1-2020的要求起草，符合标准化文件的结构、起草原则和表述规则、编排格式。2.科学性原则学习借鉴国家标准《出入境动物检疫采样》（GB/T18088-2000），鱼类血液是检验标的物之一，并在实际检测中与常规方法进行了比对验证，明确鱼类病毒性疫病核酸检测非致死采样的采样要求、采样程序、采样记录、采样方法、样品封存与运输、样品登记与保存，给出具体的要素、要求及内容，实用性、可操作性强。3.需求主导原则常规病毒性疫病采样采取组织后，往往会对被采样生物造成巨大伤害，甚至造成死亡。特别是对于一些鱼类亲本或名贵鱼类，按照常规方法采样都会给养殖户造成较大的经济损失。亟需找到一种既能满足采样需求，又能保障鱼类采样后继续存活的采样方法，本标准正是应此需求而生。（二）标准编写的主要依据1.编制依据（1）农业部渔业局关于印发《水生动物防疫工作实施意见》（试行）通知（国渔养〔2000〕16号）（2）农业农村部关于印发《生猪产地检疫规程》等22个动物检疫规程的通知（农牧发〔2023〕16号）（3）《一、二、三类动物疫病病种名录》（农业农村2.参考文献（1）谢晶,曹杰.渔用麻醉剂在鱼类麻醉保活运输中应报,2021,30(01):189-196.（2）魏锁成.用于鱼类的麻醉剂及麻醉管理[J].西北民族大学学报(自然科学版),2005(01):43-45.（3）刘长琳,何力,陈四清,李学文,邹健,李迪,齐国山.鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化,2007(05):21-25.（4）杨兴棋.鱼类的采血技术[J].淡水渔业,1979(Z1):45-46+13.（5）张平,魏京广,吴金英.鱼尾部取血的要点和关键[J].生物学通报,2020,55(12):49-50.（6）张素梅.血清与血浆标本在常规生化项目检测中的比较[J].首都食品与医药,2017,24(06):101-102.（三）主要技术内容确定依据1.标准题目专家建议删除标准题目“鱼类病毒性重大疫病核酸诊断检测非致死采样技术规范”中的“重大”，修改为“鱼类病毒性疫病核酸诊断检测非致死采样技术规范”。2.标准适用范围本文件规定了海、淡水鱼类病毒性疫病核酸检测非致死采样的基本要求、采样准备、现场采样、样品封存与运输、样品登记与保存的要求。本标准中的鱼类病毒性疫病，指的是农业农村部公布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中所涉及的鱼类病毒性疫病。目前，最新的疫病病种名录是2022年6月23日农业农其中共包括11种鱼类病毒性疫病，分别为鲤春病毒血症、草鱼出血病、传染性脾肾坏死病、锦鲤疱疹病毒病、病毒性神经坏死病、传染性造血器官坏死病、鲫造血器官坏死病、鲤浮肿病、真鲷虹彩病毒病、传染性胰脏坏死病、牙鲆弹状病本文件适用于具有保活需求的鱼类病毒性疫病的采样。3.基本要求根据《水生动物卫生法典》第1.4节水生动物卫生监测中“为了提高发现感染病例的概率，取样时应倾向于采集已感染的动物，如选择垂死动物、处于易感阶段的动物等”，提出4.1优先选择已发病、具有典型表观症状的鱼类，并及时取样。4.采样准备参照《水生动物产地检疫采样技术规范》（SC/T7103）第5章采样程序，提出了5.1采样方案的制定。根据多年来从事国家级和省级水生动物疫病监测采样工作经验以及采样中所需要的器具和设施，提出5.2工具准备：采样器具应包括一次性无菌注射器、采血管或灭菌EP管；辅助设施包括搪瓷托盘、镊子、酒精棉球、深色绒布及水桶（盆）、生理盐水等。5.现场采样在本标准中所采用的非致死采样方式为采血。经多次试验比对验证，根据不同鱼规格采集适量的血，不会导致采样鱼的死亡，即非致死采样。（1）麻醉剂的确定：采集鱼类的血液，首先要将鱼类麻醉，主要目的是既能使鱼类在采血取样时保持静止便于采血操作，又能有效降低在采血过程中鱼类出现的应激。经查阅关于鱼类麻醉的研究文献，如《渔用麻醉剂在鱼类麻醉保活运输中应用的研究进展》（谢晶，2021），渔用麻醉剂有30种以上，国内学者比较常用的渔用麻醉剂主要有MS-222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）和丁香酚2种。其中MS-222是美国食品和药品管理局（FDA）批准使用的唯一一种鱼用安全麻醉剂，而丁香酚中含有的少量甲基丁香酚是一种潜在MS-222。（2）麻醉的剂量和时间：参考研究文章《用于鱼类的麻醉剂及麻醉管理》（魏锁成,2005）及《鱼类麻醉研究综述》（刘长琳，2007）中麻醉时间和浓度的研究，同时结合多次反复试验，确定6.1中的麻醉剂量和方法：MS-222麻醉浓度为50mg/L～150mg/L，以浸浴方式进行麻醉，麻醉时间5min～15min。麻醉的剂量和时间，受样本品种、规格、水体温度等因素都有影响，剂量参照魏锁成《用于鱼类的麻醉剂及麻醉管理》中不同种类鱼类的使用浓度，根据鱼的行为表现合理确定麻醉时间，当采样鱼表现出“失去活动力、沉底、腹部朝上”症状后立刻将已麻醉鱼取出，避免过度麻（3）采血方法：参照《鱼类的采血技术》（杨兴棋，1979）中所提到的几种采血技术，结合《鱼尾部取血的要点和关键》（张平，2020），提出6.2.1中“用无菌注射器沿鱼体中线、臀鳍基部后面的鳞下刺入，推进至血管棘之间，刺破血管弧的动脉或静脉采血，取血后用酒精棉球按压采血部位1min～2min，将鱼放回水中”。（4）采血量：采血量与鱼体规格紧密相关。经过多次采血试验验证，提出6.2.2中“体长6cm～10cm鱼种，采血0.5mL；体长10cm～15cm鱼种，采血1mL～1.5mL；15cm以上大规格鱼种或成鱼，采血2mL”。在这样的采血量下，能较有效地保证鱼体存活。（5）采样记录：根据《水生动物产地检疫采样技术规范》第6章采样记录，提出了本标准6.4采样人员应认真填写《现场采样记录表》，以及《现场采样记录表》一式三份的留存单位。《现场采样记录表》里的具体填写指标根据日常进行疫病监测采样时所需要的基本信息进行设计。根据《水生动物产地检疫采样技术规范》6.1“交被采样单位负责人或业务负责人或其委托人签字确认”，结合在各地市开展采样的实际情况，提出6.4中《现场采样记录表》“由采样人、被采样单位负责人（或业务负责人或其委托人）共同签字确认”。6.样品封存与运输样品运输：根据起草单位多年采样和运输实践经验，样品运输主要是运输新鲜血液，因此提出7.2将采血后的采血管或灭菌EP管低温静置10min～20min后置冰盒中，添加柔性填充材料，专人运输，途中避免剧烈震荡，严禁倾覆颠7.样品登记与保存样品运输到达目的地后，应做好样品的登记和保存。（1）样品核验收录参照《水生动物产地检疫采样技术规范》11样品登记部分，提出8.1.1样品核验收录要求。同时，结合采样过程中遇到的问题，提出“必要时，样品及标签可拍照进行电子资料留存”。（2）血清制备特别说明：血清制备是非致死采样的非常重要的一个环节。需要在运输到实验室后，及时开展血清制备工作，血清制备完成后再进入检测及保存流程。参照《血清与血浆标本在常规生化项目检测中的比较》（张素梅，2017），同时结合多年采集鱼类血液样品后进行血清分离制备的经验，提出8.1.2“将装有新鲜血液的采血管或EP管置4℃冰箱中过夜，以3500rpm速度离心10min。分离后小心吸取上层血清，转入新的灭菌EP管中，制备成独立样本或混合样本”。（3）样品保存参照《水生动物产地检疫采样技术规范》12样品保存中的“病毒组织样品必须在-20℃以下条件保存”“水生动物产地样品，自发出检疫报告后阳性样品需保存6个月后方可作废处理”，提出8.2“样品经分样后，除一部分进入检疫检验流程外，其余部分于-80℃留样冻存。检测报告签发后，血清样品应存储6个月方可作无害化处理”。四、试验验证的分析、综述报告，预期的经济、社会和生态效益针对以采集鱼类血液进行病毒疫病检测诊断方法的灵敏度和