2026年mRNA疫苗生产用质粒DNA质量控制研究进展

汇报人:12342026/04/302026年mRNA疫苗生产用质粒DNA质量控制研究进展CONTENTS目录01

mRNA疫苗生产工艺概述02

质粒DNA生产与纯化工艺03

质粒DNA质量控制标准体系04

DNA模板残留检测技术CONTENTS目录05

国际法规与指南比较06

质量源于设计(QbD)应用07

工艺挑战与解决方案08

2026年发展趋势与展望mRNA疫苗生产工艺概述01质粒DNA的制备与线性化生产起始于质粒DNA的制备，包括基因测序、目的基因片段获取、载体设计构建、工程菌重组质粒扩增及DNA纯化等步骤。随后需将质粒DNA进行线性化处理，作为后续体外转录的模板。体外转录（IVT）与mRNA加工修饰以线性化DNA为模板，通过体外转录技术合成mRNA。此过程需确保mRNA结构完整，并进行必要的加工修饰，如5′加帽和3′加尾等，以提升其稳定性和翻译效率。mRNA纯化与脂质纳米颗粒（LNP）包封IVT反应结束后，需对mRNA进行纯化，去除工艺杂质。纯化后的mRNA与脂质体LNP进行自组装，形成纳米粒子复合物，再经浓缩、纯化和无菌过滤等工艺环节后进行灌装。线性与自复制mRNA疫苗生产流程circRNA疫苗生产工艺特点生产流程与线性mRNA疫苗的共性circRNA疫苗的制造过程类似于线性mRNA疫苗，同样涉及质粒DNA的制备、线性化DNA模板的制备和纯化、体外转录（IVT）、RNA加工和修饰、RNA纯化以及脂质纳米颗粒（LNP）包封等基本步骤。独特的环化反应步骤与线性mRNA疫苗相比，circRNA疫苗生产过程中需要对制备的RNA进行体外转录后，额外进行一个关键的环化反应，以形成其特有的圆形结构。序列与结构特征差异circRNA疫苗RNA结构为圆形，缺乏5′帽结构、3'poly(A)尾部结构以及5'和3'非翻译区（UTR）。其依靠内部核糖体进入位点（IRES）启动翻译，圆形结构增强了其稳定性。自剪接序列的应用circRNA疫苗含有具有I型或II型组内含子的自剪接序列，以诱导其RNA前体的环化。T4RNA连接酶环化法在当前制造过程中较少使用。修饰核苷酸使用情况目前正在开发的circRNA疫苗是在不使用修饰核苷酸的情况下生产的，这与一些线性mRNA疫苗的生产工艺有所不同。质粒DNA在mRNA生产中的关键作用mRNA体外转录的核心模板质粒DNA作为mRNA疫苗生产的起始原材料，其序列的准确性直接决定了mRNA的序列和后续表达的抗原蛋白。在体外转录（IVT）反应中，通常每毫升反应液需加入50μg线性化质粒DNA模板，以确保mRNA的高产率。生产工艺的起始与质量传递质粒DNA的制备是mRNA疫苗生产流程的首个关键环节，包括基因测序、目的基因片段获取、载体设计构建、工程菌重组质粒扩增及DNA纯化等步骤。其质量直接影响后续mRNA原液的质量，如宿主DNA残留等关键质量属性需在此阶段严格控制。不同mRNA疫苗类型的工艺适配对于线性mRNA和自复制mRNA疫苗，质粒DNA需经线性化处理；而circRNA疫苗的质粒DNA则需包含特定自剪接序列以诱导RNA前体环化。2026年CDE《预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》已明确将非复制型、自复制型与环状RNA疫苗的质粒DNA制备纳入规范。规模化生产的效率基础通过高产菌株筛选、发酵工艺强化及纯化工艺升级（如切向流过滤与层析策略），可显著提升质粒DNA的产量与纯度。行业目标是将单位体积质粒产量提升至少50%，以满足mRNA疫苗规模化生产对起始材料的需求。质粒DNA生产与纯化工艺02高产菌株基因工程改造策略通过基因工程技术改造大肠杆菌等宿主菌株，如优化T7RNA聚合酶表达系统或增强质粒复制起始位点活性，目标是将单位体积质粒产量提升至少50%，以满足2026年mRNA疫苗规模化生产需求。发酵工艺参数强化与控制优化发酵过程中的关键参数，如温度、pH值、溶氧量及碳氮源供给，结合高密度发酵技术，提高菌体密度和质粒拷贝数，缩短发酵周期，提升生产效率。发酵过程分析技术（PAT）应用引入实时监测系统，如在线HPLC、生物质传感器等，对发酵过程中的关键质量属性（如菌体浓度、质粒产量、代谢物水平）进行实时监控，实现数据驱动的工艺参数动态调整，保障发酵过程的稳定性和可控性。高产菌株筛选与发酵工艺优化切向流过滤与层析纯化策略

切向流过滤工艺优化采用切向流过滤（TFF）技术，通过优化膜孔径和操作参数，有效分离质粒DNA与宿主细胞杂质，提升纯化效率，为后续层析步骤奠定基础。

层析纯化技术选择结合亲和层析与多模式层析策略，针对性去除残留宿主蛋白、内毒素及其他工艺杂质，使宿主蛋白与内毒素残留降至ppm级别，满足高质量标准要求。

纯化工艺对质量属性的影响优化的切向流过滤与层析纯化工艺，可显著提高质粒DNA的纯度和超螺旋比例，确保临床级质粒超螺旋程度≥90%，内毒素水平≤0.01EU/μg，保障mRNA疫苗生产的原料质量。线性化DNA模板制备关键步骤

01质粒DNA模板的线性化处理以超螺旋质粒DNA为起始材料，通过限制性内切酶切割特定位点，将其转化为线性化DNA模板，此步骤是mRNA体外转录的前提。

02线性化DNA模板的纯化工艺采用切向流过滤与层析等纯化策略，去除未切割的质粒、酶及其他杂质，确保模板纯度，如准医疗级别质粒超螺旋程度需≥90%。

03线性化效率与完整性检测通过酶切验证确保线性化条带大小正确且无杂带，同时需评估DNA片段完整性，避免因降解影响后续IVT反应效率。

04残留宿主DNA与内毒素控制严格控制宿主DNA残留（如≤10ng/剂）和内毒素水平（如准医疗级别≤0.01EU/μg），保障模板安全性，符合相关法规要求。质粒DNA质量控制标准体系03关键质量属性(CQA)识别与控制01宿主DNA残留（HCD）控制宿主DNA残留是超螺旋质粒的关键质量属性，应严格控制其含量及片段大小。准医疗级别质粒要求内毒素水平≤0.01EU/μg，超螺旋程度≥90%。02线性化质粒DNA模板残留控制线性化质粒DNA模板是mRNA原液制备的起始原材料，其残留属于mRNA原液的放行标准。根据相关法规，mRNA原液中DNA模板残留质量标准通常设定为不超过10ng/剂量。03超螺旋含量控制超螺旋结构是质粒DNA的重要质量属性，直接影响其转录效率和稳定性。准医疗级别质粒DNA的超螺旋含量需达到≥90%的标准。04序列准确性与完整性控制确保质粒DNA序列的准确性和完整性是后续mRNA转录及疫苗有效性的基础。需通过测序验证、酶切验证等方法，确保质粒序列符合设计要求，条带大小正确且无杂带。宿主DNA残留控制标准

宿主DNA残留的法规依据中国药典2020版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留不超过10ng/剂。

CDE指导原则要求2022年5月CDE发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》建议，如使用肿瘤细胞系等，尽量将残留DNA控制在10ng/剂以内，片段大小控制在200bp以下。

mRNA疫苗中宿主DNA的特殊性mRNA原液中的DNA残留与传统疫苗不同，系特定DNA序列的残留，CDE《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》要求结合模板序列、残留量、片段大小等评价安全性风险。

宿主DNA残留与质粒DNA模板残留的区分宿主DNA残留是超螺旋质粒的关键质量属性，若超螺旋质粒中宿主DNA残留符合标准，mRNA原液通常无需检测宿主DNA残留，只需重点关注线性化质粒DNA模板残留。超螺旋含量标准准医疗级别质粒DNA要求超螺旋程度≥90%，以保证转录效率和模板稳定性，这是mRNA疫苗生产中质粒DNA的关键质量属性之一。内毒素水平控制临床级质粒DNA内毒素水平需严格控制在≤0.01EU/μg，准医疗级别要求＜10EU/mg，避免引发机体免疫反应，确保疫苗安全性。检测方法与合规性通过酶切验证、分光光度计测定等方法对超螺旋含量进行检测，内毒素检测需符合GLP规范要求，确保质粒DNA质量满足2026年《预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》等法规标准。超螺旋含量与内毒素水平要求2026版CDE指导原则最新要求适用范围扩展至多类型mRNA疫苗

首次将自复制型mRNA疫苗和环状RNA疫苗纳入系统规范，针对非复制型、自复制型与环状RNA三类疫苗，强调需根据其作用机制、产品特性和技术成熟度开展针对性研究。全生命周期药学研究的明确要求

适用于预防用mRNA疫苗的全生命周期药学研究，涵盖生产工艺、质量研究、质量标准、稳定性研究等相关药学研究的关注重点。递送系统的针对性规范

主要适用于以脂质纳米颗粒（LNP）为基础的非病毒递送系统，采用其他类型递送系统时，需根据产品相关特点和属性开展相应研究。稳定性研究的差异化考量

明确mRNA疫苗稳定性研究与评价可参照国内外生物制品稳定性研究的相关指导原则。对自复制mRNA疫苗需重点关注mRNA完整性变化趋势；对环状RNA疫苗需重点关注开环和降解风险。平台技术产品研发的考量

指出平台技术的适用性应通过产品间的可比性研究予以确认，平台技术的界定系动态界定，需随着新产品的开发、行业的发展等不断进行完善更新。DNA模板残留检测技术04定量PCR(qPCR)方法原理与应用

01qPCR方法基本原理qPCR通过对特定DNA靶序列进行扩增，利用荧光信号实时监测扩增产物的积累，实现对模板DNA的定量分析。其核心是基于扩增曲线的Ct值与起始模板量的对数呈线性关系。

02mRNA疫苗质粒DNA残留检测靶序列选择以BNT162b2疫苗为例，其qPCR检测靶序列为包含T7启动序列的69个碱基对，可特异性识别线性化质粒DNA模板残留。

03qPCR方法在mRNA疫苗质控中的法规地位USP指南草案推荐采用qPCR检测mRNA原液中的DNA模板残留，CDE指导原则也认可其作为DNA模板残留的检定方法，适用于临床申报阶段。

04qPCR方法的优势与局限性qPCR对特定序列的定量检测准确性高，但可能无法精确表征整体DNA模板残留，如降解片段长度分布、T7聚合酶遮蔽靶序列等问题可能影响检测结果。荧光染色法(Qubit)的干扰因素分析

RNA含量过高导致假阳性当混合物中RNA含量远超过10倍DNA含量时，Qubit荧光定量系统检测到的DNA含量远高于实际值，因荧光染料可能同时结合RNA。

RNase预处理可显著降低干扰研究显示，在新冠mRNA疫苗样品中加入RNase去除RNA后，Qubit检测到的DNA含量较未处理组下降100倍，有效排除RNA干扰。

特定序列检测局限性Qubit检测的是整体DNA残留，无法区分线性化质粒DNA模板的特定序列与其他DNA片段，可能高估目标模板残留量。DNaseⅠ降解效率验证方法

qPCR法检测特定靶序列残留采用定量PCR（qPCR）检测包含T7启动序列的特定靶序列（如69个碱基对），可精准定量线性化质粒DNA模板残留，是USP指南推荐及BNT162b2疫苗采用的方法。

荧光染色法评估整体DNA残留使用Qubit等荧光定量系统检测整体DNA残留时，需先经RNase处理去除RNA干扰，否则大量RNA会导致检测结果异常偏高，该方法可作为qPCR法的补充验证。

DNA片段大小分布分析依据CDE指导原则，需对DNaseⅠ降解产物的片段大小分布进行评估，建议将残留DNA片段控制在200bp以下，可结合凝胶电泳或其他片段分析技术实现。

酶活性及反应条件确认通过验证DNaseⅠ的酶活性、反应时间、温度及pH等参数，确保每毫升IVT反应液中50μg线性化质粒DNA模板被有效降解，以满足mRNA原液DNA残留≤10ng/剂的标准。残留DNA片段大小分布研究

片段大小分布的安全性风险关联线性化质粒DNA模板残留的片段大小是mRNA原液安全性风险评估的重要因素，CDE指导原则明确要求结合残留DNA片段大小等评价其安全性风险。

法规对片段大小的控制要求2022年5月CDE发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》建议，若生产使用特定细胞系，DNA残留片段大小应控制在200bp以下。

DNaseⅠ降解产物的片段分布特征目前对DNaseⅠ降解线性化DNA模板后产物的片段长度分布研究尚不充分，其分布特征是否影响检测方法的准确性及潜在风险有待深入探究。

片段分布对检测方法的潜在干扰特定靶序列（如T7启动序列）的检测结果可能无法完全表征整体DNA模板残留情况，需考虑降解片段分布是否与靶序列数量成正比例关系。国际法规与指南比较05WHOmRNA疫苗质量控制指南要点适用范围与核心目标指南适用于预防人类传染病的LNP递送、活性免疫、线性mRNA和saRNA疫苗，关注疫苗生产、质量控制、非临床和临床评估中的关键因素及监管考虑，同时为突发公共卫生事件期间快速开发优先疫苗提供建议。质量标准动态管理原则指南建议在开发早期阶段，质量标准可相对宽松，最终标准应基于在临床试验中被证实安全有效的检测批次结果，强调质量标准需随产品全生命周期发展进行动态调整。分析方法开发与验证要求要求开发和验证分析方法，以鉴定、检测纯化mRNA的纯度、含量及关键质量属性（如影响安全和质量的属性），并根据准则确定与方法学验证（如精确度）相关的可接受项目范围。多价及株系修改疫苗考量针对开发多价mRNA疫苗或修改某些病原体（如流感病毒或SARS-CoV-2）现有疫苗株的情况，提供了具体的质量控制考虑因素，确保此类疫苗的安全性和有效性。USP指南第二版新增质控项目残留T7RNA聚合酶含量检测USP指南第二版新增残留T7RNA聚合酶含量作为质控项目，旨在进一步控制mRNA疫苗生产过程中的工艺相关杂质，确保产品安全性。ELISA检测残留dsRNA针对双链RNA（dsRNA）这一影响安全性的关键杂质，USP指南第二版增加了酶联免疫吸附测定（ELISA）方法进行检测，以提高对潜在免疫原性杂质的控制水平。HPLC-CAD分析LNP脂质成分采用高效液相色谱（HPLC）与气雾式检测（CAD）联用技术，对脂质纳米颗粒（LNP）的脂质成分进行定性和定量检测，确保LNP递送系统的质量和一致性。欧洲药典5.36/5.39/5.40通用文本解读单击此处添加正文

发布背景与目标2024年4月，为满足全球对mRNA疫苗通用质量标准的需求，欧洲药典同时制定5.36、5.39、5.40三个新通用文本，旨在支持全球开发商、制造商、监管机构和国家控制实验室。5.36：人用mRNA疫苗该文本涉及人用mRNA疫苗生产和控制的关键方面，为成品疫苗的质量控制提供全面指导，确保疫苗的安全性、有效性和质量一致性。5.39：用于生产人用mRNA疫苗的mRNA物质针对生产mRNA疫苗所用的mRNA物质，规定了其生产和控制的关键要求，关注mRNA的特性、纯度、含量等质量属性。5.40：用于制备mRNA物质的DNA模板明确了用于制备mRNA物质的DNA模板的生产和控制相关关键方面，为mRNA疫苗生产的起始原材料质量提供保障。中美欧DNA残留标准对比分析

中国DNA残留标准中国药典2020版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留不超过10ng/剂。CDE《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》指出mRNA原液中的DNA残留系特定DNA序列的残留，应结合模板序列、残留量、残留DNA片段大小等评价安全性风险。

美国DNA残留标准美国药典（USP）指南草案建议采用定量PCR检测mRNA原液中的DNA模板残留。BNT162b2原液中DNA模板残留的检测方法采用qPCR，其质量标准设定为不超过10ng/剂，商业化生产的放行标准为≤330ngDNA/mgRNA。

欧洲DNA残留标准EMA在BioNTech新冠mRNA疫苗（BNT162b2）质量评估报告中，依据WHO生物药相关指导原则建议，将mRNA原液中残留DNA模板的质量标准设定为不超过10ng/剂。欧洲药典正在制定的人用mRNA疫苗相关通用文本，将涉及DNA残留等关键质量控制方面。质量源于设计(QbD)应用06质量目标产品概况(QTPP)建立

QTPP核心要素确定基于QbD框架，从患者需求出发，明确mRNA疫苗生产用质粒DNA的关键质量目标，包括序列准确性、超螺旋结构占比、纯度（如宿主DNA残留、内毒素水平）及稳定性等核心要素，确保其作为起始原材料的安全性与有效性。

安全性指标设定参考《预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》及相关法规，设定严格的安全性指标，如宿主DNA残留需符合超螺旋质粒放行标准，内毒素水平应控制在准医疗级别（如<0.01EU/μg），以降低潜在免疫原性风险。

有效性相关属性要求确保质粒DNA具有高转录效率，序列完整性需通过测序验证符合设计要求，酶切验证无杂带，超螺旋含量≥90%，为后续mRNA体外转录（IVT）提供优质模板，保障mRNA疫苗的表达效率。

质量标准动态调整机制根据产品全生命周期理念，结合工艺验证数据及临床批次结果，建立QTPP的动态调整机制。早期研发阶段可适当放宽标准，随着工艺成熟度提升，逐步收紧关键质量属性（CQA）范围，如DNA残留片段大小控制在200bp以下。关键工艺参数(CPP)与CQA关联模型01CPP与CQA关联模型的构建基础基于质量源于设计（QbD）框架，通过实验设计（DOE）工具，分析制造过程对产品关键质量属性（CQA）的影响，从而定义关键工艺参数（CPP）范围，建立数学关系模型。02质粒DNA生产中的典型CPP-CQA关联示例例如，发酵工艺中的温度、pH值和溶氧浓度等CPP，直接影响质粒DNA的产量、超螺旋比例（CQA）；纯化工艺中的层析流速和缓冲液离子强度，影响宿主DNA残留和内毒素水平（CQA）。03模型在mRNA疫苗生产中的应用价值该模型用于确定产生所需CQA的CPP范围，创建设计空间及正常工作范围（NOR），可实现对mRNA疫苗生产过程的精准控制，如某研究利用此模型构建的mRNA疫苗平台，可生产多分散指数（PDI）≤0.30、粒径为60–180nm的疫苗。实验设计(DOE)在质粒生产中的应用发酵工艺参数优化通过DOE筛选高产菌株，优化发酵培养基成分与培养条件（如温度、pH、溶氧），可将单位体积质粒产量提升至少50%，为规模化生产奠定基础。纯化工艺条件筛选针对切向流过滤（TFF）与层析纯化步骤，利用DOE优化滤膜孔径、流速、洗脱缓冲液配方等参数，有效降低宿主蛋白与内毒素残留至ppm级别。关键质量属性影响因素分析应用DOE评估发酵时间、诱导剂浓度等对质粒超螺旋含量（目标≥90%）、纯度（A260/A2801.8~2.0）等关键质量属性的影响，建立工艺与质量的数学关系。工艺稳健性与放大验证通过DOE确定关键工艺参数（CPP）的设计空间，确保从实验室小试到商业化生产的工艺稳健性，减少批间差异，符合GMP及2026年《预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》要求。工艺挑战与解决方案07T7RNA聚合酶残留控制技术

T7RNA聚合酶残留的风险与质控要求2023年4月USP指南第二版新增残留T7RNA聚合酶含量作为mRNA疫苗质控项目，其残留可能影响mRNA转录效率及引发免疫原性风险，需严格控制。

基于qPCR的T7RNA聚合酶残留检测方法采用针对T7RNA聚合酶特定基因序列的qPCR方法，可实现高灵敏度检测，需验证其特异性、精密度及线性范围，确保检测限满足质量标准。

亲和层析法去除T7RNA聚合酶工艺优化通过优化镍离子亲和层析或抗体亲和层析条件，如缓冲液pH值、洗脱梯度等，可有效降低T7RNA聚合酶残留，结合工艺验证确保去除效率稳定。

工艺过程控制与残留量监测策略在mRNA纯化阶段设置关键工艺控制点，采用过程分析技术（PAT）实时监测T7RNA聚合酶残留趋势，结合多批次数据建立正常工作范围（NOR），保障产品质量。dsRNA杂质深度去除策略

dsRNA杂质的来源与风险dsRNA主要产生于体外转录（IVT）过程，尤其是使用T7RNA聚合酶体系合成长链mRNA时易形成，具有较强免疫原性，可能引发机体非特异性免疫反应，影响疫苗安全性和有效性。

IVT反应体系优化抑制dsRNA生成通过优化IVT缓冲液中MgCl₂浓度、精确控制NTPs摩尔比，可将dsRNA杂质生成量降低50%以上；引入新型T7RNA聚合酶突变体及辅因子工程，能减少长链mRNA合成中的提前终止和副产物产生。

多模式层析纯化技术应用采用多模式层析或反相层析等纯化策略，可针对性去除dsRNA杂质。例如，核苷酸修饰mRNA平台需更复杂的层析步骤以有效分离dsRNA，提升mRNA原液纯度，满足质控要求。

修饰核苷酸的引入与杂质控制在mRNA合成中引入N1-甲基假尿嘧啶等修饰核苷酸，可降低mRNA的先天免疫原性，同时减少dsRNA等副产物的生成，虽增加工艺复杂度，但能通过优化工艺将对产能的负面影响降至最低。连续化生产工艺平台构建

核心工艺节点连续化整合将质粒DNA制备、体外转录（IVT）、mRNA纯化及LNP包封等关键工艺环节进行连续化整合，通过自动化设备与控制系统实现物料的连续转运与处理，缩短生产周期，提升工艺稳定性。

生产过程分析技术（PAT）应用引入在线HPLC、拉曼光谱等PAT工具，对关键质量属性（如mRNA完整性、LNP粒径分布）进行实时监测，构建数据驱动的工艺参数动态调整机制，实现从“离线检验”向“在线放行”转变。

无菌连接与转移技术改造采用先进的无菌连接技术，优化生产过程中的物料转移环节，减少人工干预，降低污染风险，为大规模、连续化的mRNA原液生产提供坚实的无菌保障。

设备与工艺兼容性验证对连续化生产所涉及的生物反应器、层析系统、微流控混合设备等进行系统性兼容性验证，确保各设备间参数匹配及工艺流畅性，满足2026年规模化生产需求。2026年发展趋势与展望08智能化质量控制技术应用前景PAT技术实时监测