CN112105912B 用于单生物纳米颗粒分析的方法和设备 （华盛顿大学）

2020.10.13PCT/US2019/0250332019.03.29WO2019/199499EN2019.10.17US2017045451A1,2017.02.16ChristopherL.Kuyperetal..Real-MicrofluidicChannelsUsingConfCorrelationSpectrosco本公开涉及用于进行生物纳米颗粒分析的物纳米颗粒移动通过微流体芯片时对样品进行2使所述多个生物纳米颗粒的部分流过所述至少一个微流体在所述至少一个微流体通道中，逐个颗粒地照射来自所述多个生物纳米颗粒的部分在检测区域内用检测器检测发射自所述至少一个生物纳米颗粒的背向散射光强度或基于检测到的背向散射光强度或落射荧光强度为在所述至少一个被照射的生物纳米9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述多个生物纳米颗粒的部分中超过至少一个微流体通道内的横截面积小于10µm2的检测14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述检测光强度包括使用光收集系17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述生物纳米颗粒与可检测试剂结318.如权利要求17所述的方法，其中，所述可检测试剂与所述生物纳米颗粒的表面连米颗粒的表面连接，所述多种可检测试剂中的至少一种处于所述生物纳米颗粒的表面中，22.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其26.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中30.如权利要求20-29中任一项所述的方法，37.如权利要求1所述的方法，其中所述尺寸所述测量的光强度相对具有已知尺寸或尺寸分布的标准物进行校准来确定所述生物纳米440.如权利要求38-39中任一项所述的方法，其中，所述45.如权利要求37-44中任一项所述的方法，其中，所46.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其中，所述标准53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，还包括对具有所述尺寸值的生物纳米颗粒577.如权利要求75-76中任一项所述的方78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，81.如权利要求75-80中任一项所述的方法，其中，所述最大横截面积的值小于250,82.如权利要求1-81中任一项所述的方法，其中83.如权利要求1-82中任一项所述的方法，其中84.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中85.如权利要求1-84中任一项所述的方法，所述微流体芯片包括在结点处相交的多个86.如权利要求85所述的方法，其中，一个通道在88.如权利要求1-87中任一项所述的方法，所述检测来自至少一个生物纳米颗粒的光692.如权利要求91所述的方法，还包括确定所述至少一个生物标志物的至少一个拷贝时，超过3500万个颗粒/小时，超过4000万个颗粒/小时，超过4500万个颗粒/小时或超过98.如权利要求1-97中任一项所述的方法，还包括将所述至少一个纳米颗粒分选到富102.如权利要求98-101中任一项所述的方法，其中，所述富集群的直径方差小于7118.如权利要求110-117中任一项所述的方法，还包括将所述生物纳米颗粒分选到富124.如权利要求119-123中任一项所述的方法，还包括将所述生物纳米颗粒分选到富8[0002]本申请要求2018年4月13日提交的美国临时申请号[0003]微流体已成为生物分析研究的重要组成部分。成功的微流体生物分析应用包括括诊断和监测癌症以及检测病毒-细胞相互作用。微型流式细胞仪已成为传统流式细胞仪米级系统诸如亚细胞细胞器，并且可能缺少必要的分选速度和通量或信息内容(例如尺寸[0005]通过使用例如超速离心对生物纳米颗粒进行浓缩完成了对亚细胞细胞器和其他9括在检测区域中用检测器检测发射自所述至少一个生物纳米颗粒的[0011]在一些方面中，所述至少一个微流体通道包括至少一个收缩部(constriction[0012]在一些方面中，所述方法包括测量发射自所述至少一个生物纳米颗粒的光强米颗粒的内部内，或其组合。在一些方面中，所述多种可检测试剂具有重叠的发散谱[0022]在一些方面中，所述方法包括对具有所述尺寸值的生物纳米颗粒的数量进行定一个通道在一个结点处与至少3个不同的微流体通道相交。在一些方面中，结点没有死体[0030]在一些方面中，所述指定尺寸值使用经受激发射损耗(stimulatedemission富集群的直径方差小于100％。在一些方面中，所述富集群具有下述直径范围：直径值的生物纳米颗粒发射的可检测光强度来测量生物纳米颗粒少一个微流体通道包括收缩部。在一些方面中，所述装置还包括询问源(asourcefor多个捕获分子中的至少一些来捕获所述多个纳米颗粒中的至[0045]在一些方面中，所述流体样品的至少部分的层厚度为小于10mm、小于9mm、小于片。在一些方面中，所述多个隔室包括微流体通道。在一些方面中，所述容纳装置是块[0052]在一些方面中，所述方法还包括将所述容纳装置连接于所述至少一个平面表与所述涂层结合的生物纳米颗粒的数量比省略所述离心步骤的对比实验多至少100其多个捕获分子中的至少一些捕获所述多个纳米颗粒中的至少一颗粒集中于微流体芯片的平面中且与微流体芯片的平有被生物纳米颗粒包封的体染料以及与生物纳米颗粒的表面结合的染料的生物纳米颗粒。图5B显示了发射自体染料和表面染料的强度可以与生物纳米颗粒的表面积[0082]图7显示了当与荧光染料结合的生物纳米颗粒通过检测束并被激发时所检测到的[0090]图15A-B显示了在有和没有离心的情况下在涂覆的平坦表面上捕获的生物纳米颗有离心的情况下在涂覆的平坦表面上捕获的生物纳米颗粒数[0092]图17A-B显示了具有单染料分子灵敏度的微流体芯片和光学设备，并且其利用内部校准(Au纳米颗粒)来标准化不同测量之间检测到的光信号。图17A显示了这样的微流体[0093]图18显示了使用Au纳米颗粒作为用于校准两次测量之间强度的内标物实现对单[0095]图20A-C显示了使用不同的有色抗体在单个囊泡上对不同蛋白质生物标志物的共了从与经Alexa647标记的针对VATPase(蛋白B)的抗体结合的囊泡检测到的光子尖峰。图20C显示了对同一囊泡上蛋白A(图20A)和蛋白B(图20B)之间共定[0096]图21A-D显示了使用与囊泡上不同蛋白质特异性结合的不同颜色的抗体以及报告显示了这样的信号时间轨迹，其显示了从用膜染料ANEPPS标记的囊泡所检测到的光子尖于与膜染料的共定位而结合至囊泡的抗体的荧光强度[0097]图22A-C显示了使用与囊泡上不同蛋白质特异性结合的不同颜色的抗体以及报告完整膜结合体积存在和/或囊泡尺寸的体染料对单个囊泡上不同蛋白质生物标志物的共定位。图22A显示了这样的信号时间轨迹，其显示了从用体染料俄勒冈绿二乙酸(Oregon显示了从与经Alexa647标记的针对SV2A的抗体结合的囊泡检测到的光子尖峰。图22C显示了对同一囊泡上体染料俄勒冈绿和抗-SV2A荧光抗体之间共定位的互相关分析；共定位百[0098]图23A-D显示了使用来自金纳米颗粒的背向散射光作为内标物的信号强度校准。图23A显示了这样的信号时间轨迹，其显示了从用膜染料ANEPPS标记的外来体所检测到的光子尖峰。图23B显示了这样的信号时间轨迹，其显示了从金纳米颗粒所检测到的光子尖[0099]图24A-C显示了这样的荧光图像，其显示了外来体上的尺寸依赖性蛋白表达。图捕获材料的珠已被用于分离感兴趣的颗粒(参见例如，Lee,NanoLett,2014,14(1),第足和/或导致回收效率低。体液中生物纳米颗粒的低浓度可以导致使用常规方法捕获和分最大光收集和/或最小失真的高数值孔径物镜)的兼容性以促进对移动时生物纳米颗粒的[0107]在某些方面中，穿过微流体装置的微流体通道行进的纳过微流体装置时发射的光强度的方法允许在所述纳米颗粒移动时将尺寸值指定给纳米颗为使用微流体装置以高频率和高通量提供了令人惊讶的对检测和/或分选事件的高效分度没有高于阈值极限的各测量的样品指定为值0，从而形成二进制排序。在其他实施方式微流体芯片为操纵、分离、分选和/或运输生物纳米颗粒提供了一个有吸引力且通用的平过使用具有高数值孔径的物镜、透镜或光收集系统来促进对生物纳米颗粒的检测和分析，进对生物纳米颗粒的检测和操作(例如，使用三个或更多个流体通道结点处的流动位移进或鉴定。微流体芯片和使用微流体芯片的设备允许大量生物纳米颗粒以快速的方式被运焦通道，以将纳米颗粒集中于微流体芯片的平面中且与微流体芯片的平面垂直(例如参见的流动将来自输入通道的第二流体的流动引导至第一输出通道、第二输出通道或其组合。[0120]在一些方面中，硅主板可使用两个光刻工艺来制造。特征可以使用标准软件(例用例如十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，后用等离子体氧化的标准工艺来粘合盖板玻璃片以完[0124]在一些实施方式中，微流体芯片包括至少一个第一输入通道和至少两个出口通或多个输入流动通道(即，将生物纳米颗粒带入检测体积的通道)和一个或多个输出通道个通道在结点处与至少个不同的通道在微流体芯片上不是结点的位置与另一[0130]在某些实施方式中，微流体装置是平面装置并能够用于高数值孔径检测或成可以使用数值孔径等于或大于1.2的光收集系统对平面[0131]在一些实施方式中，所述微流体芯片是平面装置并且包含至少一个微流体通度小于50小于45小于40小于35小于30小于25小于20小于15小于14小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5小于4小于3小于2％或小于1％的微流体通道最大宽度。作为非限制性实例，50小于45小于40小于35小于30小于25小于20小于15小于14%,小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5%,部的高度小于50小于45小于40小于35小于30小于25小于20小于15小于14小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5小于4小于3小于2％或小于1％的微流体通道最大高度。作为非限制50小于45小于40小于35小于30小于25小于20小于15小于14%,小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5%,在一些实施方式中，收缩部的横截面积小于50小于45小于40小于35小于30小于25小于24小于23小于22小于21小于20小于19小于18%,小于17小于16小于15小于14小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5小于4小于3小于2小于1小于0.5小于0.2小于0.1小于0.05小于0.02小于0.01小于0.005小于小于25,000μm2且大于250μm2，小于10,000μ缩部的横截面积小于50小于45小于40小于35小于30小于25小于24%,小于23小于22小于21小于20小于19小于18小于17小于16小于15小于14小于13小于12小于11小于10小于9小于8小于7小于6小于5小于4小于3小于2小于1小于0.5小于0.2小于0.1%,小于0.05小于0.02小于0.01小于0.005小于0.002％或小于0.001％的微流体小于25,000μm2且大于250μm2，小于10,000μm2m2222222m2包括在其宽度或高度中的至少一个中具有阶梯梯度(stepgradient)或阶梯变化的微流体[0153]在一个方面中，本公开提供了用于检查和测量流体样品中生物纳米颗粒的装米颗粒移动通过微流体芯片时进行检测和/或[0158]在本文提供的装置和设备的某些实施方式中，装置可以进一步包括一个或多个[0162]在某些实施方式中，本文提供的设备可以包括由壁围绕和/或在基材上微制造的的实施方式中，声学元件和/或鞘流聚焦不足以充分操纵本文所公开的方法和设备的生物可以可以基于纳米颗粒或与生物纳米颗粒结合的微磁性或纳米磁性颗粒的磁化率来增强速变化或电渗流变化来操纵选定颗粒或细胞进一步包括一个或多个电阻加热元件以进行芯片上细胞实验，如聚合酶链反应(PCR)或实而进一步连续检查或分选包含可检测试剂(16且基于生物纳米颗粒所发射的光强度来测量生物纳米颗件可以用于确定流体样品中特定生物纳米颗粒用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(RAM)以及其中储存固定指令的只读存储器(ROM)。文件存储子系统为程序和数据文件提供了非临时持久性(非易失性)存体动力学直径小于1μm。在具体实施方式中，在生物纳米颗粒位于微流体芯片内时进行测可通过非共价相互作用如范德华力或静电力被包埋在生物纳米颗体染料和表面结合可检测试剂的纳米颗粒可以提供与生物纳米颗粒表面积和体积有关的为对生物纳米颗粒如外来体具有特异性的酶的荧光底物的体染料的使用可以进一步提供第二可检测试剂分组包含多种体染料，其中所有体染料具有相同的发散和吸收谱和峰波可以使用第一可检测试剂分组的发射光强度和第二可检测试剂分组的发射光强度提供关检测试剂与生物纳米颗粒结合，并且可以校准检测器以检测由发射自可检测试剂的荧光在一些实施方式中，询问源包括落射照射。在一些实施方式中，询问源包括线共焦检测650nm-约750nm，约700nm-约800nm，约750nm-约850nm，约800nm-约900nm，约850nm-约小于1000nm。在一些方面中，通过光过滤设备的最短波长大于200nm，大于300nm，大于剂的生物纳米颗粒的光谱强度可包括检测或测量由探针在两个或多个波长(例如，在两个[0209]在一些实施方式中，发射的光强度可以包括这样的波长或波长范围，其包括斯特共振能量转移(resonanceenergytransfer，FRET)猝灭一个或多个发色团，更多。可光转换发色团的实例包括但不限于：Dronpa、rsFastLime、Padron、bsDronpa、辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-交替-共-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}]乙烯基](MEH-PPV)和聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-戊二烯-b-环氧乙烷)和聚(异戊二烯-b-N-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)；基于聚(环氧乙烷)环氧乙烷)PEO末端官能OH；以及基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物，如聚(乙烯基吡咯烷[0218]此外，可检测试剂可以例如是存在于待分析的生物纳米颗粒中的感兴趣的分子散射)来分析生物纳米颗粒。适用于本公开的多种可检测试剂为本领域所周知且可以例如[0219]使用本文所述的检测方法，可以分析生物纳米颗粒与可检测试剂的结合或不结[0222]单个生物纳米颗粒的照射可以指包括多个生物纳米颗粒的流体样品中并在多个生物纳米颗粒的照射不同于随机共定位于照射区域的两个或多个生物纳米颗粒(即，恰好存在于照射区域内的两个或多个生物纳米颗粒)的照射。单个生物纳米颗粒的照射不同于他生物纳米颗粒中任何一个不存在的情况下穿过光束，因此单个生物纳米颗粒被自身照[0223]检测来自单个生物纳米颗粒的光强度可以指包括多个生物纳米颗粒的流体样品中并在多个生物纳米颗粒中其他生物纳米颗粒中任一个不存在的情况下被检测的生物纳米颗粒。单个生物纳米颗粒的检测不同于生物纳米颗粒的聚集(即两个或多个生物纳米颗其在多个生物纳米颗粒中其他生物纳米颗粒中任[0224]在一些实施方式中，多个生物纳米颗粒中多个生物纳米颗粒的至少部分被照射生物纳米颗粒测量)。在一些实施方式中，多个生物纳米颗粒中大于10大于20大于30大于40大于50大于55大于60大于65大于70更大大于75大于80大于85大于90大于95大于96大于97大于98％或大于99％经照射的[0225]在一些实施方式中，多个生物纳米颗粒中多个生物纳米颗粒的至少部分被检测20大于30大于40大于50大于55大于60大于65大于70更大大于75大于80大于85大于90大于95大于96大于97大于98％或大于99%通过一个区域(例如具有给定宽度的光束)的观察。作为以逐个颗粒为基准的非限制性实多个生物纳米颗粒的至少一些单独通过光束(即，在多个生物纳米抗体中其他生物纳米颗粒中任一个不存在的情况下)。作为关于以逐个颗粒为基准的生物纳米颗粒的另一非限制施方式中，多个经照射的生物纳米颗粒中大于10大于20大于30大于40大于50大于55大于60大于65大于70更大大于75大于80大于85大于90大于95大于96大于97大于98％或大于99％的生物纳米颗粒被逐个颗粒地粒地照射。在一些实施方式中，多个被检测的生物纳米颗粒中大于10大于20大于30大于40大于50大于55大于60大于65大于70更大大于75大于80大于85大于90大于95大于96大于97大于98％或大于99％的生物纳颗粒包含单个分子。单分子检测可以包括点检测，其中检测聚焦在空间区域(例如，点或一宽度的光束或照射点的光束)，并且检测来自所述空间区域的光可以对应于生物纳米颗单光子雪崩二极管(SPAD)，硅光电倍增管(SiPM)和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感m2222222222222222m222222222交和/或位于至少一个微流体通道的收缩部[0229]在一些实施方式中，用于询问的至少一个源询问区域(在本文中也称为“照射区m2222222222222222m2222222222μm2或小于1μm2。在优选实施方式中，照射区域的面积大于或等于1μm2且小于或等于100μm2称为信号积分时间)可以在直方图中公开发生或观察到事件的时间范围。在一些实施方式粒为基准的检测描述了由多个生物纳米颗粒检测单数生物纳米颗粒。在一些实施方式中，以逐个颗粒为基准包括单行(single-file)检测，在多个生物纳米颗粒的部分通过微流体粒为基准表示多个生物纳米颗粒中的至少一些之间粒的检测和/或照射单个生物纳米颗粒可以指包括多个生物纳米颗粒的流体样品中，但在多个生物纳米颗粒中其他生物纳米颗粒中任一个不存在的情况下被照射和/或照射的生物米颗粒中任何一个不存在的情况下穿过光束，因此单个生物纳米颗粒被自身检测和/或照某些实施方式中，多个生物纳米颗粒中检测到的多个生物纳米颗粒中至少1％的部分以单颗粒的部分中至少90％检测到的生物纳米颗粒以单个生物纳米颗颗粒的部分中各个生物纳米颗粒之间的体积(并且在具有宽度的微流体通道中，描述了空物纳米颗粒之后和检测和/或照射另一生物纳米颗粒之前通道微流体通道的流体的体积。纳米颗粒的部分之间的平均空隙距离比多个生物纳米颗粒的部分的平均流体动力学直径平均空隙距离足以使多个生物纳米颗粒中至少90％的部分逐个颗粒地通过检测和/或照射而形成照射区域)照射和/或用检测器检测(从而形成检测区域)的至少一个微流体通道的10,000个生物纳米颗粒/秒、小于5,000个生物纳米颗粒/秒或小于1,000个生物纳米颗粒/少两个生物纳米颗粒可以一次一个(即，不聚集在一起)通过微流体通道的检测区域和/或物纳米颗粒与多个生物纳米颗粒的部分中其他生物纳米颗粒中包括平行的10个微流体通道，并且用于辐射的4个源可以5μm间隔照射这10个微流体通道；第一生物纳米颗粒。可以使用本领域已知的方法来确定第二生物纳米颗粒的真实尺寸值，一部分可以使用本文所公开的方法通过微流体芯片处理并指定相对尺寸值以生成直方图，[0255]在通过将尺寸值与生物纳米颗粒所发射的相对光强度相关联来为生物纳米颗粒践中可能很难满足此要求，因为测量的光强度会受到许多难以控制的实验可变性的影响，力学直径范围为40-100纳米的尺寸值测量动态光散射(DLS)来确定，并且指以与被测量的生物纳米颗粒相同的方式扩散光的硬纳米-10纳米之间或40纳米-10纳米之间。在某些实施方式中，流体动力学直径在1,000纳义为具有二进制开/关周期的检测方法，其中开周期与检测来自生物纳米颗粒的光强度高 T开[0264]用于测量、检测和/或分选流体样品中生物纳米颗粒的方法和设备的非限制性实品引入微流体芯片(1603)，所述微流体芯片包括通过微流体通道连接的入口和两个出口。值并向下游移动，在此将其分选(未示出的用于引导流动的机制)至正微流体通道(1621)，Fab本身是由二硫键接合到VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以打断用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature348:552-554是使用与外来体反应的染色剂。其他染料实例包括荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的小鼠抗-人上皮抗体(HEA)和藻红蛋白(PE)偶联的抗-CD63。染料偶联的抗体的其他实例包括但NY-BR-1(也称为B726P，ANKRD30A，锚蛋白重复域30A)；B305D同种型A或C(B305D-Aro基-d-半乳糖胺:多肽N-乙酰基半乳糖胺基转移酶6或GALNT6)；CK7(也称为细胞角蛋白7，肾细胞癌乳头状2型，RCCP2，原癌基因或MET)；粘蛋白-1(也称为MUC1，癌抗原15.3，D2)乳球蛋白2(MGB2；也称为乳球蛋白B，MGBB，乳球蛋白(Lacry酸蛋白酶抑制剂(乳腺丝抑蛋白(Maspin)，也称为丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂进化件下与抗体的特异性结合需要针对其对特定生物纳米颗粒的特异性而选择的抗体。例如，可以选择多克隆抗体以获得仅与所选抗原而不与其他蛋白质发生特异性免疫反应的那些用于引导流的机制通过计算机和代表引导算[0281]在某些实施方式中，该方法可以包括通过收集和/或汇集具有相似排序的生物纳含软件的计算机，用于基于尺寸值和/或与生物纳米颗粒结合的一种或多种可检测试剂的式中，其中装置用于检测多种尺寸的生物纳米颗粒和/或其中装置用于检测多种类型的生物纳米颗粒和/或其中装置用于检测与生物纳米颗粒结合的多种类型的可检测试剂，排序体芯片的透明或半透明性质允许检测发射自生流式细胞仪对生物纳米颗粒进行进一步分区(partition)或分选，或者可以对感兴趣的生可能与前列腺癌的进展相关；外来体miRNA-21和miRNA-1246的水平升高可能与食道癌相患者尿液中外来体miRNAmiR-320c和miR-6068可能上调。关于进行性退行性疾病，几种过使用包括超过一个询问装置和/或超过一个检测装置的设备同时检测体积中的生物纳米颗粒结合的生物标志物或可检测试剂在检测发生的生物纳米颗粒之后发生的次级过程。可以与本文提供的方法偶联的过程和/或功能的实例碳水化合物或封装在生物纳米颗粒内或与生物纳米颗粒复合的蛋白质)。这些反应包括聚与实验方案偶联。可以与本文提供的方法偶联的试验的非限制性实例包括基于核酸的方细胞仪的偶联允许对选定的生物纳米颗粒进行进一步检查或连续分选以进一步富集感兴[0303]在本文所提供的方法的一个实施方式中，如果生物纳米阈值的各生物纳米颗粒指定为值1，而将未发射出光强度高于可检测阈值的各生物纳米颗生物纳米颗粒的值可以被指定为2，且与A和B两者都结合的生物纳米颗粒的值可以被指定种类型的生物纳米颗粒各自可以发射这样的光强度，所述光强度与流体动力学直径在20-行计数或分选事件(例如，具有对应31-40nm流体动力学直径尺寸值且与可检测的试剂A结[0311]在一些实施方式中，指定给生物纳米颗粒的值中的至少一个可以是生物标志物纳米颗粒可以包含与生物标志物A-结合的纳米颗粒的部分——可以将二进制生物标志物米颗粒相区别。标志物的至少一个拷贝数的方法。拷贝数的确定可以提供鉴定生物纳米颗粒和/或与生物丝氨酸蛋白酶抑制剂(乳腺丝抑蛋白(Maspin)，也称为丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂粒可以包含与标签A结合的纳米颗粒的部分——可以将二进制标签值应用于生物纳米颗的纳米颗粒将指定为负值，从而允许检测和/或分选与感兴趣的标签结合的生物纳米颗与生物纳米颗粒结合的体染料的信号，衍生自与生物纳米颗粒的核酸结合的染料的信号，衍生自与生物纳米颗粒的脂质结合的染料的信号或衍生自与生物纳米颗粒结合的染料的富集群是通过生物纳米颗粒的尺寸值和生物标志物值确定的。在本公开的某些实施方式物标志物值。本文公开的方法包括特定生物标志物的检测以及基于生物标志物值的分选。富集群体还具有该富集群体的置信区间，其中该置信区间大于99大于98大于97%,大于96大于95大于90大于80大于70％或大于50％。在优选实施方式中，置信运动。[0328]在本公开的一些实施方式中，其中流体样品中存在超过一种类型的生物纳米颗[0329]在本公开的另一实施方式中，其中流体样品中存在超过一种类型的生物纳米颗将与第二类型的可检测试剂结合的生物纳米颗粒引导至第三通道或第合或稀释的生物纳米颗粒进行进一步分区，从而使生物纳米颗粒划分成不同的等分试样。[0335]在某些实施方式中，流体流动控制装置(如用于引导流体动力学流体压力或流体驱动力方法和装置所列举的那些)可以与本公开的输入端口或输出端口偶联。在一个实例的微流体装置中具有特定排序的400个生物纳米颗粒的流体样品可以导致对具有所述排序30-50nm的生物纳米颗粒的数量进行定量可以提供总计数为6,000个检测到的共有该尺寸倍至5倍，那么在这些界限内观测到的任何生物纳米颗粒都将记录为峰。在一些实施方式多个生物纳米颗粒确定靶向用可检测试剂A标记的生物纳米确定使用相同条件进行分析并存在5个峰/ms的峰频率的具有未知浓度的所需生物纳米颗过将金纳米颗粒的峰频率与生物纳米颗粒的峰频率进行比较可以确定样品溶液中生物纳生物纳米颗粒以下述速率通过所述微流体芯片：超过1百万个颗粒/小时，超过2百万个颗以超过500万个纳米颗粒/小时的速率移动通过微流体[0352]在某些实施方式中，本公开提供了用于在平面表面上捕中的至少一些捕获多个纳米颗粒中的至少一些；和(e)用荧光显微镜对平面表面上的多个任何一种都可以用于向平面表面施加涂层或以其在优选的实施方式中，平面表面的尺寸是用户友好的和/或可以使用本领域技术人员已知100cm21cm2-1mm2、表面积为75mm2-光显微镜分析玻璃盖玻片以分析捕获的生物纳种防污底材料为本领域所周知且可以例如在期刊论文(例如，Hucknall等Adv.Mater.,(例如，羧基甜菜碱)，牛血清白蛋白(BSA)，低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)，聚以与涂层相互作用并粘附至捕获分子的距离(例如，当生物纳米颗粒在离心力的影响下通[0382]在某些方面中，本公开提供了进一步包括提供包含多个优选实施方式中，与涂层结合的生物纳米颗粒的数量比省略离心步骤的对比实验多至少与捕获分子连接。如本文在生物纳米颗粒和捕获分子的上下文中所使用，术语“如本文在生物纳米颗粒和涂层的上下文中所层包含蛋白质如抗体或链霉亲和素，然而未冻干的样品可能会在该段时间内降解或解离。[0399]在一些实施方式中，分析包括测量来自与涂层结合的生物纳米颗粒的发射光强可以将包含多种可检测试剂的流体引入涂层，其中可检测试剂与生物纳米颗粒特异性结TMTM-二丁基巴比妥酸)三次甲基花青碘化物(3,3-dipentyloxcarbocy[0419]在某些实施方式中，至少一个平面表面具有表面积，其中所述表面积为200cm2-100cm2，所述表面积为150cm2-80cm2，所述表面积为150cm2-1cm2，所述表面积为200cm2-包括至少一个询问源和设置成检测捕获的生物纳米颗用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(RAM)以及其中储存固定指令的只读存储器(ROM)。文件存储子系统为程序和数据文件提供了非临时持久性(非易失性)存能存在具有比本文所示系统更多或更少的组件实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本公开的情况下可以作出多种改[0448]该实施例描述了通过测量微流体装置中观察到的背向散射的量来确定生物纳米将信号聚焦到雪崩光电二极管。通过雪崩光电二极管观察到的背向散射的量是强度读数，并且其取决于颗粒穿过检测束所需的时间以及颗以及随着时间推移具有基本恒定的速度。将包含具有已知直径的5种类型的颗粒的流体标[0460]获得具有尺寸范围为30nm-150nm的外来体的标准物。使用具有动态光散射的[0463]该实施例描述了通过测量被颗粒包围的荧光试剂发射的光来确定颗粒尺寸的方[0467]获得标准物，其具有尺寸范围为30nm-150nm的外来体。使用具有动态光散射的量进行比较，并且获得染色的外来体的未校正的强度分布(图4D)。体染料直方图覆盖有[0470]该实施例描述了通过测量与颗粒结合的荧光试剂发射的光来确定颗粒尺寸的方[0480]未知胞外囊泡的尺寸通过体染料的校正强度与表面膜染料的校正强度的比例确表面染料的囊泡注入入口。将检测束波长设置为了最大程度地荧光激发体染料和表面染[0489]该实施例描述了通过测量颗粒穿过两个激发束时与颗粒结合的荧光试剂发射的[0494]使用发射结果计算占空比/关闭周期。将信号宽度计算的阈值设置为最大强度的总长度是从强度首先超过阈值的点(颗粒进入第一束)的点到其降至最后阈值以下(颗粒离0.170.830.250.750.510.490.670.330.810.19[0501]该实施例描述了通过测量与外来体结合的荧光剂在外来体穿过由受激发射损耗[0503]图10提供了由STED束修饰的单束的谱。如上述实施例5中详细描述的那样产生激发束。该激发束与两个STED束部分重叠，所述STED束的波长大于激发束的波长(λSTED＞λ激发[0507]该实施例描述了通过测量与外来体结合的荧光剂在外来体穿过由受激发射损耗[0508]开发不依赖于局部速度来确定流动中的颗粒尺寸的方法对筛选过程是有益的。次进入第一有效激发区域到外来体的后缘离开第二有域的宽度(S)的实际值。包含50nm外来体或脂质体或其他纳米颗粒的标准物在其移动通过[0522]包含30nm外来体或脂质体或其他纳米颗粒的第二标准物在其移动通过整个检测[0527]开发出来用于确定流动中外来体尺寸的方法被应用于通过尺寸对外来体进行分[0532]该实施例描述了使用Au纳米颗粒作为内标来确定单个纳米颗粒上生物标志物拷焦检测系统对来自单染料分子的荧光和单Au纳米颗粒的背向散射进行高灵敏度和高通量间的液位高度差(大约5-10mm)，无需外部泵即可轻松启动流动，这使得操作简单。对于633nm的激光器，照明激光线的长度约为20μm(图17A)。使633nm激光线比通道的宽度长十于检测Au纳米颗粒的背向散射光，以用作内标来校准检测到的来自生物纳米颗粒的光强[0535]此外，上述和图17A-B中描述的微流体芯片和设备用于对与单个纳米颗粒结合的生物标志物的拷贝数的信息还提供了关于纳米颗粒的功能、种类和/或生物学状态的重要饰的玻璃盖玻片的厚度与高数值孔径(数值孔径为1.4)荧光成像相兼容。该修饰的玻璃盖玻片附着于PDMS块，所述PDMS块在与玻璃盖玻片组装之前打出1-cm大小的洞(图14，步骤[0541]将包含精液外来体的样品加入各经处理的链霉亲和素-抗体-PEG涂覆的盖玻片孔度小于水)添加到样品顶部以防止蒸发。然后将修饰的盖玻片组件装入板式离心机中(图且最大发射波长为约570nm)添加到修饰的盖玻片中并孵育5分钟。也可以添加对外来体具[0549]将囊泡样品与针对囊泡上两种不同蛋白质的两种不同颜示了来自Alexa561标签标记的抗体针对囊泡蛋白VGLUT1的检测信号时间轨迹；使用561nm处的激光激发来激发Alexa561标签。图20B显示了来自Alexa647标签标记的抗体针对囊泡[0550]图20C显示了来自图20A和图20B所示的两个颜色通道的信号的共定位分析(互相后时间或位移时间τ的重叠。[0553]在两个颜色通道中均发出信号(光子尖峰)的单个囊泡报告了囊泡上存在的两种[0559]将稀释的样品引入微流体通道。图21A显示了来自ANEPPS标记的外来体的检测信CD63的Alexa647标签标记的抗体的检测信号时间轨迹；使用640nm处的激光激发来激发[0560]图21C显示了来自图21A和图21B所示的两个颜色通道的信号的共定位分析(互相关图)。共定位的互相关分析显示了同一囊泡上膜染料ANEPPS和抗-CD63荧光抗体的存在。图20D显示了来自囊泡(与膜染料共定位)和来自未完全从样品中移出的游离抗体检测到的[0561]在两个颜色通道中发射信号(光子尖峰)的单囊泡验证了检测到的抗体信号来自结合到单囊泡的抗体的荧光强度以及膜染料的荧光强度所报告的囊泡大小还能够确定囊敏度。图19显示了所使用的设备的示意图，其具有四个不同的激光激发和21个不同的APD示了来自Alexa647标签标记的抗体的检测信号时间轨迹；使用640nm处的激光激发来激发[0568]图22C显示了来自图22A和图22B所示的两个颜色通道的信号的共定位分析(互相位能够使不同组的生物标志物的存在与报告存在完整膜结合的体积的体染料和/或与囊泡的荧光强度以及体染料的荧光强度所报告的囊泡体积还能够确定囊泡生物标志物的拷贝[0571]该实施例描述了使用来自用作内标的金纳米颗粒的背向散射光来校准由单个囊[0573]首先将精液外来体样品与ANEPPS(4-[2-[6-(二辛基氨基)-2-萘基]乙烯基]-1-(3-磺丙基)-吡啶)膜染料孵育以标记[0574]将包含金纳米颗粒的精液外来体囊泡样品引入微流体通道。图23A显示了来自膜示了来自金纳米颗粒的背向散射光的检测信号时间轨迹；可以使用四种不同激光(405nm、[0575]图23C和图23D分别显示了ANEPPS标记的外来体(图23C)和金纳米颗